單核細胞增生李斯特菌，簡稱單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)，是不形成芽胞的革蘭陽性(G+)短桿菌，具有需氧或兼性厭氧特性，兼性胞內寄生，作為一種食源性病原菌(foodborne pathogen)，可導致李斯特菌病(listeriosis)，患者表現為胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產或死胎等，病死率(case fatality rate)高達20%?30%[1-3]。Lm能低溫生長，最低生長溫度可達?0.4℃[4]，對冷藏食品的安全構成嚴重威脅，并對人類健康造成潛在的危害。目前，Lm低溫生長的具體機制不明，研究Lm低溫生長機制能為防控李斯特菌病的暴發(fā)提供理論依據。
Durack等[5]通過分析處于低溫4℃條件下生長的Lm菌株的轉錄組數據發(fā)現，與鞭毛合成相關的基因表達明顯地下調，處于被抑制狀態(tài)；運動性試驗結果顯示，在4℃培養(yǎng)條件下菌株運動圈的直徑顯著小于25℃培養(yǎng)條件。Cordero等[6]比較了Lm在低溫8℃生長條件下生長快的菌株與生長慢的菌株的運動性，發(fā)現生長快的菌株的運動性顯著弱于生長慢的菌株；轉錄組數據顯示生長快的菌株的鞭毛合成基因表達顯著下調。所以，Lm能低溫生長與抑制鞭毛基因表達以減少鞭毛的合成有關，其具體機制未見報道。
Lm鞭毛基因中的flaA是個單順反子，其編碼鞭毛絲蛋白FlaA，其他鞭毛基因主要分布在394、397和398這3個操縱元上(圖1)[6-7]。Lm在機體環(huán)境或37℃培養(yǎng)條件下，鞭毛基因被阻遏蛋白MogR抑制，不產生鞭毛，無運動性[8-9]；當Lm處于外界環(huán)境或20?30℃培養(yǎng)條件時，MogR被抗阻遏蛋白GmaR抑制，MogR對鞭毛基因表達的抑制被解除，Lm合成鞭毛，能運動[10-11]。因此，我們推斷Lm低溫生長時鞭毛量減少可能與MogR抑制鞭毛基因表達有關。為了驗證此推斷，本文以Lm ATCC 19115為親本株，構建阻遏蛋白MogR基因缺失株ΔmogR及其回補株cΔmogR，同時還構建了鞭毛絲蛋白FlaA基因缺失株ΔflaA(作為無鞭毛對照株)及其回補株cΔflaA，測定各菌株在低溫下的運動性、鞭毛形成狀況和鞭毛基因表達情況，以及測定所構建的菌株在低溫下的生長情況，以探究MogR對Lm低溫下鞭毛形成的影響，為闡明Lm低溫生長機制提供新的信息。
1材料與方法
1.1菌株、質粒和引物
本研究所涉及的細菌菌株和質粒如表1所示。所用引物均由武漢擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表2所示。
1.2主要試劑
牛腦心浸出液肉湯(brain heart infusion,BHI)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；氨芐青霉素(ampicillin,Amp)和紅霉素(erythromycin,Erm)購自武漢華大至善生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶和反轉錄試劑盒等購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega Bio-Tek公司；電鏡負染液磷鎢酸(phosphotungstic acid,PTA)購自中國科學院武漢病毒研究所；用于熒光定量PCR的2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)購自武漢擎科生物科技有限公司。
圖1單增李斯特菌鞭毛基因操縱元[6-7]
表1細菌菌株和質粒
1.3缺失株ΔmogR和ΔflaA及其回補株cΔmogR和cΔflaA的構建
以ATCC 19115為模板，用引物mogR(L)-F/R和mogR(R)-F/R(表2)擴增mogR上下游同源臂(圖2)。Overlap PCR連接上下游同源臂，將同源臂融合產物連接到自殺型溫敏穿梭質粒pHT304-ts中，獲得含有mogR上下游同源臂基因的重組質粒p2102N。轉化p2102N入大腸桿菌DH5α后，由武漢天一輝遠生物科技有限公司對p2102N中的同源臂序列進行測序，測序結果符合預期。提取p2102N，電轉化(2.4 kV)于ATCC 19115感受態(tài)細胞，鑒定獲得陽性轉化子后，利用同源重組原理篩選，獲得缺失株ΔmogR(圖2)。除用引物flaA(L)-F/R和flaA(R)-F/R(表2)擴增flaA上下游同源臂外，缺失株ΔflaA的構建方法同ΔmogR。用引物mogR-F/R(表2)擴增包括自身啟動子的mogR，連接于穿梭載體pHT304，獲得重組質粒p2201，對p2201中的目的基因片段進行測序，提取測序正確的重組質粒電轉化入缺失株ΔmogR感受態(tài)細胞中，PCR鑒定，獲得回補株cΔmogR。除用引物flaA-F/R(表2)擴增包括自身啟動子的flaA外，回補株cΔflaA的構建方法同cΔmogR。