據(jù)WHO估計(jì)，全球約有1/3的人口是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者，其中有5%～10%的人會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性肺結(jié)核。潛伏期結(jié)核分枝桿菌存在于肉芽腫組織中，這是一種低氧、高一氧化氮、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的微環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌在此環(huán)境中處于休眠期，生長(zhǎng)速度非常緩慢，也正是因?yàn)槿绱?，結(jié)核分枝桿菌逃避了機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，從而存活下來。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌基因組存在著一組包含48個(gè)基因的休眠存活調(diào)節(jié)子(DosR),這48個(gè)基因編碼的蛋白控制著結(jié)核潛伏期的生理過程。肉芽腫組織中的結(jié)核分枝桿菌存在著依賴氧壓的細(xì)胞和生化動(dòng)力學(xué)機(jī)制，能夠使其快速適應(yīng)微環(huán)境改變的能力，在此過程中結(jié)核分枝桿菌DsoR基因起著至關(guān)重要的作用。與活動(dòng)期結(jié)核分枝桿菌相比，DosR區(qū)域編碼的抗原能夠引起潛伏期結(jié)核患者產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這表明DosR基因很可能在潛伏期特異性表達(dá)。有研究報(bào)道，DosR基因編碼的許多蛋白有助于結(jié)核分枝桿菌利用其他碳源途徑獲得能量，如乙醛酸代謝、硝基還原和脂肪酸代謝等。探索DosR基因生物學(xué)功能有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)結(jié)核分枝桿菌潛伏期的生理調(diào)控過程，從而有針對(duì)性地進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的，對(duì)于預(yù)防活動(dòng)性結(jié)核的發(fā)生至關(guān)重要。
1材料與方法
1.1儀器與試劑本實(shí)驗(yàn)試劑結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，載體pET30a由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司；膠回收試劑盒購(gòu)自Zymo公司；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司；DNA聚合酶和連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Sigma公司。美國(guó)Biorad酶標(biāo)儀。
1.2方法
1.2.1結(jié)核分枝桿菌DNA的提取
結(jié)核分枝桿菌DNA的提取依據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)進(jìn)行。具體方法如下：挑取結(jié)核分枝桿菌菌落，置于裝有200μL生理鹽水的1.5 mL離心管中，80℃煮沸滅活30 min，12 000 r/min離心15 min后，加入蛋白酶K和溶菌酶充分裂解結(jié)核分枝桿菌，然后用酚-氯仿抽提法獲取結(jié)核分枝桿菌基因組，無水乙醇沉淀雙鏈DNA，干燥后TE緩沖液(50μL)溶解DNA。
1.2.2引物設(shè)計(jì)
在DBGET數(shù)據(jù)庫(kù)中查找結(jié)核基因Rv2029c的全基因序列，然后采用Primer5.0和Oligo6.0設(shè)計(jì)Rv2029c特異性引物序列，上下游分別插入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物序列為上游引物Rv2029F：CGG AAT CCA TGA CGG AGC CAG CGG CGT，其中CG是保護(hù)性堿基，GAA TCC是EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物Rv2029R：CCC AAG CTT TCA TGG CGA GGC TTC CGG GTT，其中CCC是保護(hù)性堿基，AAGCTT是HindⅢ酶切位點(diǎn)。
1.2.3純化目的
基因采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸80 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的目的基因利用膠回收試劑盒(美國(guó)Zymo公司膠回收試劑盒，D4007)進(jìn)行純化和濃縮。具體方法如下：首先在瓊脂糖凝膠上準(zhǔn)確切取目的基因片段，然后加入凝膠溶解液，37～55℃孵育融化5～10 min后，過柱離心吸附，加Washing buffer洗滌2次后，用10～20μLTE緩沖液洗脫即可。
1.2.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組
質(zhì)粒PE730a-Rv2029c的構(gòu)建依據(jù)文獻(xiàn)，主要概述如下：用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)目的基因和載體pET30a進(jìn)行雙酶切，然后經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。目的基因和載體按3∶1的比例，在DNA連接酶的作用下，16℃過夜連接。連接后的目的基因，導(dǎo)入到大腸埃希菌感受態(tài)(BL21)細(xì)胞中，4℃水浴30 min后，42℃準(zhǔn)確熱激45 s后，加入無抗菌藥物的LB培養(yǎng)液后，細(xì)菌復(fù)蘇45 min，然后將細(xì)菌均勻涂到含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿中，37℃過夜后挑取陽性單克隆菌落并提取質(zhì)粒(北京天恩澤公司質(zhì)粒提取試劑盒，60205)，雙酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)鑒定后送南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序分析。
1.2.5重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c促生長(zhǎng)作用
研究大腸埃希菌BL21是一種常用的基因工程表達(dá)菌株，其生長(zhǎng)分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期和衰亡期。遲緩期大腸埃希菌適應(yīng)新的環(huán)境，因此生長(zhǎng)速度很慢，對(duì)數(shù)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分，細(xì)菌呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，大腸埃希菌代謝產(chǎn)物不斷積累，培養(yǎng)基pH逐漸下降，大腸埃希菌生長(zhǎng)速度變慢，細(xì)菌總數(shù)趨于穩(wěn)定。大腸埃希菌的平臺(tái)期與結(jié)核分枝桿菌的肉芽腫微環(huán)境相似，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)都是一種不利的環(huán)境，以此模擬肉芽腫微環(huán)境，將結(jié)核DosR蛋白導(dǎo)入大腸埃希菌BL21中，觀察對(duì)其生長(zhǎng)有無影響。
取出保存的pET30a大腸埃希菌(空質(zhì)粒組)和pET30a-Rv2029c大腸埃希菌(重組質(zhì)粒組)，在含50μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，記錄吸光度(OD)600值。然后將菌液調(diào)整至相同的OD值并吸取600μL菌液加至300 mL LB培養(yǎng)基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃300 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取600μL菌液，檢測(cè)OD值(每次測(cè)3組OD值，每組測(cè)200μL)。在第5個(gè)小時(shí)當(dāng)2組大腸埃希菌OD值為0.45時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(500 mmol/L),之后繼續(xù)每隔1 h取600μL菌液測(cè)OD值，如此連續(xù)重復(fù)測(cè)量15 h。在相同條件(相同菌種，相同生長(zhǎng)和測(cè)量條件)下重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS22.0對(duì)1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量的方差分析及t檢驗(yàn)，比較空質(zhì)粒組與重組質(zhì)粒組對(duì)大腸埃希菌OD值是否產(chǎn)生影響，并作出生長(zhǎng)曲線圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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