巨噬細胞實驗
進行J774巨噬細胞的體外毒力測定，以確定巨噬細胞吞噬和殺死巴西利亞孢子絲菌酵母的能力，以及這種相互作用后巨噬細胞的活力。將J774系巨噬細胞在培養(yǎng)板中單層生長，培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、10%NCTC-109、1%非必需氨基酸和1%青霉素/鏈霉素，稀釋于Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，于37°C，10%CO2條件下培養(yǎng)，并分裝到96孔板中。將5株巴西利亞絲孢酵母菌的酵母細胞，預先用豚鼠血清補體調理30分鐘，以5:1的比例加入巨噬細胞單層。
體內實驗
為了評估體內毒力，使用25μL Hamilton®注射器給大蠟螟幼蟲接種10^4、10^6或10^7個5株巴西利亞孢子絲菌分離株之一的酵母（稀釋于10μL PBS中），并分析幼蟲存活率。作為對照，一組幼蟲接種巴西利亞孢子絲菌參考菌株(CBS120339)。陰性對照組包括未接種的幼蟲（"Control"）和注射10μL無菌PBS的幼蟲（"PBS"）。這些實驗在不同日期進行了三次重復。每組由20只幼蟲組成，在90 mm培養(yǎng)皿中于37°C下維持，每天評估大蠟螟。在第0天（接種日）和第2天（接種后48小時）對組進行拍照。死亡的幼蟲（通過缺乏主動或觸摸誘導的運動且通常顏色變深來識別）從組中移除并丟棄。獲得生存曲線以比較分離株對幼蟲的影響。
在相同條件下平行設置每組10只幼蟲用于CFU測定。在接種后3天或6天處死每組3只幼蟲。將內部內容物研磨并在2 mL PBS中勻漿，然后通過40μm細胞濾網(wǎng)過濾。取100μL勻漿液涂布于含有0.4 g/L放線菌酮和1%青霉素/鏈霉素的BHI瓊脂上以防止污染，并在37°C下孵育。五天后測定CFU。
推定毒力因子的體外產(chǎn)生
a.脲酶
為了驗證脲酶的產(chǎn)生，將相當于2.0麥氏比濁度的各分離株酵母細胞懸浮液0.5 mL接種于4.5 mL Christensen尿素肉湯中，并在37°C下孵育。在4天和7天后，將試管在1,575 g下離心，并將100 uL上清液一式三份轉移到96孔聚苯乙烯平底板中。新型隱球菌(ATCC32045)和近平滑念珠菌(ATCC22019)分別用作陽性和陰性對照。使用Biotek分光光度計在559 nm波長下獲得樣品吸光度。
b.蛋白酶
蛋白酶活性的測量如下所述，使用以下混合物：2%瓊脂，15 mM葡萄糖，13 mM甘氨酸，29.4 mM KH2PO4，10 mM MgSO4，3 mM硫胺素，0.1%azoalbumin(pH 4.5)。對于蛋白瓊脂清除試驗，將各分離株的酵母細胞通過穿刺接種于該混合物上，并在37°C下孵育21天。孵育后，檢查菌落周圍是否產(chǎn)生azoalbumin降解暈圈。當觀察到蛋白水解活性時，用毫米尺測量菌落直徑和azoalbumin降解暈圈直徑，并計算p/z值作為兩個直徑的比值。
c.黑色素
根據(jù)Almeida-Paes等人描述的方法獲得黑色素"幽靈"。然后通過簡單的DHN-黑色素/酵母干重比計算每個分離株的二羥萘黑色素比例。
耐熱性
將5株分離株的酵母在37°C的BHI肉湯中生長，3天后，將2 mL酵母溶液離心，重懸于PBS中，并進行10倍稀釋以獲得3種不同稀釋度。將2.5μL液滴接種于BHI瓊脂平板上，并在35、37或39°C的培養(yǎng)箱中孵育。在3天和6天后，檢查平板以定性確定是否存在菌落生長。
生長曲線
將5株分離株的巴西利亞孢子絲菌酵母細胞在37°C的BHI肉湯中生長3天。根據(jù)Medina等人描述的方法稍作修改，使用Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀連續(xù)評估濁度作為生長的測量指標。使用制造商提供的Easy Bioscreen Experiment軟件記錄數(shù)據(jù)。
對氧化劑的敏感性
將每株分離株的真菌細胞（1 x 10^7酵母）在37°C的BHI瓊脂斜面上生長5天后收獲，用PBS洗滌3次，并提交給化學產(chǎn)生的一氧化氮、活性氮中間體和氧衍生氧化劑，如先前所述。在37°C下與氧化劑孵育1、2、3和4小時后，將酵母涂布于平板計數(shù)瓊脂上，通過CFU計數(shù)確定存活性。未處理的細胞等分試樣也作為對照涂布。每個分離株在某個時間點的存活率是該時間點的CFU計數(shù)/對照CFU計數(shù)的比值，以百分比表示。
抗真菌藥敏試驗
根據(jù)臨床和實驗室標準研究所方案使用分生孢子進行藥敏試驗。使用CLSI描述的用于絲狀真菌（包括申克孢子絲菌）的微量肉湯稀釋法M38-A2，研究了5株分離株對兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑和特比萘芬的敏感性（0.016-8μg/mL）。將細胞稀釋于RPMI 1640中，最終濃度為2 x 10^4至1 x 10^5細胞/mL。對于兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑，最低抑菌濃度終點是完全抑制生長的最低濃度。對于酮康唑，MIC是使生長減少50%的最低濃度，對于特比萘芬，是使生長減少至少80%的最低濃度。
統(tǒng)計檢驗
在分析中使用非參數(shù)檢驗（例如，Kruskal-Wallis檢驗比較生長曲線和CFU，Kaplan-Meier估計量用于大蠟螟存活率，Log-rank檢驗用于比較生存曲線）來比較5株分離株，P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。使用GraphPad Prism 6 for Windows,GraphPad Software,Inc.進行圖表構建和統(tǒng)計。使用Microsoft Excel 2010/2013進行百分比計算和分析。
結果
分子鑒定
5株分離株的T3B PCR指紋圖譜顯示300至800 bp的DNA片段，通過與巴西利亞孢子絲菌模式菌株獲得的圖譜相似性可以清晰鑒定（圖2）。此外，所有患者分離株產(chǎn)生的圖譜呈現(xiàn)100%相似性。
通過BLAST分析將分離株的β-微管蛋白和幾丁質合成酶序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，將這些分離株鑒定為巴西利亞孢子絲菌，相似性為99-100%。此外，將所有分離株的部分β-微管蛋白和幾丁質合成酶序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中可用的孢子絲菌復合體參考菌株進行比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示與巴西利亞孢子絲菌相似，并且兩個基因均顯示出高bootstrap支持值（圖3A和B）。分離株5的部分幾丁質合成酶序列與前4株分離株相比有一個2-bp的多態(tài)性（位置109 A/C和151 G/C），表明該分離株在系統(tǒng)發(fā)育分析中存在變異性。獲得的β-微管蛋白和幾丁質合成酶編碼基因序列已存入GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KM222420至KM222429。
體外實驗
為了表征其毒力，進行了使用J774巨噬細胞的體外實驗，包括吞噬作用、真菌殺滅和巨噬細胞活力測定。有趣的是，分離株之間沒有發(fā)現(xiàn)差異，使用巴西利亞孢子絲菌模式菌株獲得了類似的結果。酵母與巨噬細胞相互作用2小時后的吞噬指數(shù)范圍從分離株5的89%到分離株4的95%，巨噬細胞無法抑制巴西利亞孢子絲菌的生長，18小時后的真菌存活率在96%至123%之間變化。在此時間點后，所有條件下巨噬細胞活力約為90%（范圍從分離株5的89%到分離株3的92%）。
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