摘要：減毒沙門氏菌VNP20009具有較好的在腫瘤中定殖、復(fù)制并發(fā)揮一定抗腫瘤作用的特性，可作為抗癌藥物載體或與其他療法（如化療）聯(lián)用，具有較好應(yīng)用前景。本文對VNP20009的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，檢測了VNP20009在不同溫度、pH值及H?O?作用下的生長曲線及細(xì)菌生物膜的形成。結(jié)果表明，VNP20009在42 ℃、弱酸性環(huán)境pH 6.5以及H?O?（1 mmol·L?1）條件下可正常生長，弱酸性環(huán)境有益于VNP20009生物膜的形成。本實驗結(jié)果對深入研究減毒沙門氏菌的生存機制和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
減毒型沙門氏菌VNP20009被用來抗腫瘤已被多篇文獻(xiàn)報道，其不僅可利用自身毒性抗腫瘤，還可作為載體攜帶質(zhì)粒和小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, shRNA）。通過VNP20009所攜帶的質(zhì)粒表達(dá)的外源蛋白［例如內(nèi)皮抑素（endostain）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）和C末端截短型Fas相關(guān)死亡域蛋白（C-terminal tail Fas associated via death domain, N-FADD）等］具有很好抗腫瘤作用。除了在動物模型上驗證到良好的抗腫瘤作用外，VNP20009已作為抗癌藥物進(jìn)行了臨床Ⅰ期的驗證。目前圍繞VNP20009的研究主要集中于抗腫瘤活性藥效學(xué)，其微生物學(xué)特點未被仔細(xì)研究，將妨礙人們對該菌株特性的深入認(rèn)識和了解，并將限制其應(yīng)用和轉(zhuǎn)化。為了更好利用VNP20009，對其進(jìn)行基礎(chǔ)生物學(xué)研究是必要的。
細(xì)菌生物膜是細(xì)菌聚集后形成的黏稠狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可形成自我保護機制，保護細(xì)菌免受外界環(huán)境影響。細(xì)菌生物膜由細(xì)菌、多糖以及細(xì)菌分泌物組成，生物膜中的細(xì)菌一般不受環(huán)境壓力、抗生素、消毒劑和宿主免疫系統(tǒng)的影響。因此細(xì)菌生物膜的形成情況與細(xì)菌抵御被清除有著密切關(guān)系。
本文研究了沙門氏菌VNP20009在不同環(huán)境條件（溫度、pH值和不同濃度H?O?）的生長狀況以及生物膜的形成，為VNP20009的深入研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。
材料與方法
試劑與儀器：酵母提取物和胰蛋白胨（Oxoid公司）；M63培養(yǎng)基緩沖液（合肥博美生物科技公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）、pH儀（瑞士METILER TOLEDO公司）、恒溫?fù)u床（上海知楚儀有限公司）、細(xì)菌培養(yǎng)箱（德國MEMMERT公司）。
菌株及生長條件：沙門氏菌VNP20009由本實驗室保種。將保存于20%甘油（-80 ℃）的菌種在無抗生素的LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基（1%蛋白胨、1% NaCl、0.5%酵母膏和1.5%瓊脂粉，高壓滅菌）進(jìn)行過夜活化，挑選單克隆菌接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，按1∶100比例接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min?1培養(yǎng)至對數(shù)生長期（A???：0.6～0.8），作為樣品菌備用。評價VNP20009在3種條件下的生長及細(xì)菌生物膜形成：①溫度（37、42和45 ℃）；②pH值（7.0、5.0、6.5和8.5）；③H?O?（0、1、1.5、2、2.5和5 mmol·L?1）。
細(xì)菌生長曲線的測量：使用酶標(biāo)儀連續(xù)24 h檢測不同條件下VNP20009的生長曲線。將樣品菌按1%接種量接種于不同條件（pH值、H?O?）的LB培養(yǎng)基中，每孔加入200 μL菌液至96孔板，5孔重復(fù)，于37、42和45 ℃連續(xù)檢測。通過GraphPad Prism 8.0軟件，采用修改的Gompertz模型擬合生長曲線，公式如下：
其中，A：細(xì)菌初始數(shù)量；C：細(xì)菌初始數(shù)量和最大數(shù)量之間的差值；μ_m：最大比生長率；λ：菌株生長滯后時間。將獲得的A值和培養(yǎng)時間的數(shù)據(jù)分別代入上述公式中的y和t，得到生長擬合曲線。
不同環(huán)境條件的細(xì)菌菌落形成測試：
溫度和pH值應(yīng)激：樣品菌連續(xù)10倍稀釋，每個稀釋濃度取2 μL點于LB瓊脂培養(yǎng)基上，分別于37、42和45 ℃靜置培養(yǎng)12 h。pH值分別為5.0、6.5和8.5，以pH 7.0的標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基作為對照，37 ℃培養(yǎng)12 h。
H?O?應(yīng)激：樣品菌按1%接種至含H?O?（0、1、1.5、2、2.5和5 mmol·L?1）的LB培養(yǎng)基中，室溫靜置處理3 h，分別進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，每個稀釋濃度取2 μL點于LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。
細(xì)菌存活率統(tǒng)計：將1×10??稀釋水平的菌液（2 μL）于不同條件下培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌落統(tǒng)計，每個條件5次重復(fù)。
細(xì)菌生物膜生成：通過評估細(xì)菌細(xì)胞在玻璃管上的黏附性，檢測生物膜的形成。①將VNP20009樣品菌接種至5 mL新鮮生物膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基（上述實驗條件的LB培養(yǎng)基中添加5×M63培養(yǎng)基），分別于37、42或45 ℃、110 r·min?1培養(yǎng)36 h；②棄菌液，用去離子水洗去結(jié)合松散的細(xì)菌，室溫下用1%結(jié)晶紫溶液染色30 min后，在氣液交界處出現(xiàn)紫環(huán)狀生物膜。用去離子水清洗至試管流出液為無色，倒置烘干；③用Image J軟件對試管上形成的紫色生物膜進(jìn)行定量分析。
統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件表示成平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤［mean ± SEM（standard error of mean）］，兩組間差異性分析用t檢驗，P < 0.05表示具有顯著性差異。使用GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。
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