間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓、脂肪、子宮內(nèi)膜息肉、牙髓、外周血、胎盤、子宮內(nèi)膜、臍帶血、臍帶華通氏膠等組織中提取出，其致瘤性低，臨床應(yīng)用相對(duì)安全。其中，臍帶華通氏膠具有來源易得、可在無創(chuàng)且無菌的條件下獲取、分離方法簡(jiǎn)便、分離的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量多且增殖能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。并且，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性，不會(huì)引起宿主的免疫排斥；安全性良好，不具致瘤性；不存在倫理爭(zhēng)議。這些優(yōu)點(diǎn)均為后期的臨床應(yīng)用及轉(zhuǎn)化提供了便利性與安全性的保障。
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）因其來源廣泛、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中備受關(guān)注。由于從機(jī)體組織分離得到的hUMSCs數(shù)量有限，而傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)所得的細(xì)胞數(shù)有限，且培養(yǎng)過程中因使用胎牛血清（FBS）而不符合臨床應(yīng)用要求，故需建立臨床級(jí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUMSCs）規(guī)?；瘮U(kuò)增技術(shù)。此外，hUMSCs成骨分化能力低，限制了其在疾病治療中的應(yīng)用，因此有必要增強(qiáng)hUMSCs成骨分化能力。
在人體中，骨骼系統(tǒng)將各種骨系統(tǒng)性的排列起來，為機(jī)體提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和保護(hù)器官的作用。膝關(guān)節(jié)作為一個(gè)負(fù)荷承載器，作用是使上肢保持穩(wěn)定，并幫助人完成各種日?；顒?dòng)，如行走、跑步、跳躍、玩耍等。膝關(guān)節(jié)位于髖關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)之間，是人體內(nèi)一種最大、最復(fù)雜的下肢關(guān)節(jié)。由三個(gè)突出的關(guān)節(jié)骨（股骨、脛骨和髕骨）組成，支持人體的幾乎所有活動(dòng)和全部重量。
骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是最常見的關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為局部退行性病變，可能主要發(fā)生在一個(gè)關(guān)節(jié)處或涉及多個(gè)關(guān)節(jié)病變。它較常發(fā)生在較大的承重關(guān)節(jié)如膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)等部位，以及手和脊柱等小關(guān)節(jié)處。OA影響全球估計(jì)超過3億人，其中在美國(guó)估計(jì)有超過5000萬人，中國(guó)有2610萬人（1990年），后上升至6120萬人（2017年）。骨性關(guān)節(jié)炎影響了全球約10%的男性和18%的女性，其中女性骨關(guān)節(jié)炎患病率高于男性。膝關(guān)節(jié)處的骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteo arthritis,KOA）是全球各種肌肉骨骼疾病中最常見的關(guān)節(jié)疾病，約占全球骨性關(guān)節(jié)炎總負(fù)擔(dān)的85%。
KOA的臨床特征是關(guān)節(jié)功能障礙、疼痛、僵硬、活動(dòng)受限。其中最突出的是疼痛，僵硬在早上或長(zhǎng)時(shí)間坐著后更嚴(yán)重，同時(shí)伴有不穩(wěn)定（關(guān)節(jié)屈曲或擺動(dòng)）、抽搐和僵硬，導(dǎo)如步行、運(yùn)動(dòng)和舞蹈等活動(dòng)能力喪失。疼痛在疾病發(fā)展過程的早期與關(guān)節(jié)使用有關(guān)，但隨著時(shí)間的推移可能變得難以預(yù)測(cè)。10%的KOA患者無法進(jìn)行日常生活活動(dòng)，甚至導(dǎo)致身體殘疾。就殘疾負(fù)擔(dān)而言，2015年骨關(guān)節(jié)炎占全球殘疾生活年限（Global Years of Living withDisability）的3.9%，到2020年，預(yù)計(jì)它將成為全球殘疾生活年限的第四大原因。另外，骨關(guān)節(jié)炎通常會(huì)引起并發(fā)癥，這可能是缺乏體力活動(dòng)、藥物毒性和炎癥細(xì)胞因子的聯(lián)合作用。許多骨關(guān)節(jié)炎患者，特別是老年患者（65歲及以上），將會(huì)伴有一種或多種并發(fā)癥。
骨關(guān)節(jié)炎治療的基礎(chǔ)包括運(yùn)動(dòng)、適當(dāng)?shù)捏w重減輕，以及對(duì)那些沒有禁忌癥的患者輔以局部或口服非甾體抗炎藥（NSAIDs）。其有效的非手術(shù)治療選擇有限。骨關(guān)節(jié)炎癥狀晚期和結(jié)構(gòu)損傷的患者只能進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)，且當(dāng)前由OA引發(fā)的髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)率增加，強(qiáng)調(diào)對(duì)有效非手術(shù)治療的迫切需要。
盡管基于MSCs的細(xì)胞療法有望用于疾病治療，但在將該細(xì)胞進(jìn)行廣泛的臨床應(yīng)用之前，仍存在諸多挑戰(zhàn)。由于MSCs在諸如骨髓、臍帶血、滑膜、牙髓、胎盤、臍帶等組織中的存在比例較低，因此對(duì)于許多臨床適應(yīng)癥的治療應(yīng)用，必須將MSCs分離并進(jìn)行體外擴(kuò)增。為滿足臨床應(yīng)用要求，離體擴(kuò)增的這一階段應(yīng)在符合良好組織培養(yǎng)規(guī)范和良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）要求的培養(yǎng)條件下完成，在MSCs擴(kuò)增過程中不引入異源成分，且在嚴(yán)格的封閉操作系統(tǒng)中進(jìn)行，保證MSCs產(chǎn)品的安全性。但是，直到現(xiàn)在，胎牛血清（FBS）仍作為大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的補(bǔ)充劑，F(xiàn)BS中異源成分的存在使經(jīng)FBS培養(yǎng)的MSCs輸入人體內(nèi)可能引起機(jī)體免疫反應(yīng)。
因此，在保證無異源物質(zhì)污染的基礎(chǔ)上，建立有效的MSCs體外擴(kuò)增體系是一個(gè)亟待解決的問題。
現(xiàn)有技術(shù)中已有的干細(xì)胞的制備來源有限，且在干細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程中涉及多種蛋白酶以及動(dòng)物源性的培養(yǎng)材料的使用，這對(duì)后續(xù)制備獲得的干細(xì)胞制劑的進(jìn)一步應(yīng)用帶來了較大的障礙，存在制備的干細(xì)胞使用受限的不足。
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中干細(xì)胞制備方法不足的問題，提供一種新的干細(xì)胞的制備方法。本文提供的P1代和P8代細(xì)胞均具有良好的生長(zhǎng)曲線和增殖能力，說明采用上述方法制備的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具備較強(qiáng)的自我更新和繁殖能力。
將制備獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎的小鼠，可以顯著抑制小鼠骨贅形成，能顯著促進(jìn)關(guān)節(jié)間隙擴(kuò)大，抑制硬化骨產(chǎn)生，有效的減輕骨質(zhì)增生的作用，并且加快軟骨分層，促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)增加，有利于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療和改善。
臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及步驟：
1）取新鮮臍帶，分離獲得華通氏膠并置于細(xì)胞裂解液中浸泡；
2）處理后的華通氏膠用生理鹽水洗滌，置于培養(yǎng)皿中，CO2
細(xì)胞培養(yǎng)箱放置2h后，向組織塊中加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；
3）每隔7天左右，觀察細(xì)胞并進(jìn)行換液補(bǔ)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)，將貼壁的臍帶組織重新平鋪于新的培養(yǎng)皿，進(jìn)行二次組織貼壁培養(yǎng)；
4）加入含有胰蛋白酶替換物的PBS處理細(xì)胞團(tuán)，待細(xì)胞分散后，離心后采用完全培養(yǎng)基重懸，獲得第一代hMSCs。
臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖性實(shí)驗(yàn)
將P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度分別接種6塊96孔板，從細(xì)胞接種到96孔板后的24 h開始，采用CCK-8法測(cè)定，測(cè)量7天，取6塊培養(yǎng)板的測(cè)定平均值繪制出生長(zhǎng)曲線。測(cè)定結(jié)果參見下表1，對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線圖參見圖1。
表1：P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線測(cè)定數(shù)值
圖1P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖
從測(cè)定結(jié)果來看，P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在前4天均呈現(xiàn)明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，其中第四天的細(xì)胞密度約為第一天的4倍，后期，由于空間和營(yíng)養(yǎng)的限制，細(xì)胞不再快速增殖，進(jìn)入滯長(zhǎng)期，此外，P5和P8代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)高度擬合，且每天的吸光度數(shù)值之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明所檢測(cè)的P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在體外保持增殖活力并且具有相似的增殖能力與生長(zhǎng)規(guī)律，進(jìn)一步表明，采用本方法制備的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，不同代之間，生長(zhǎng)規(guī)律近似，性質(zhì)穩(wěn)定，具備良好的增殖規(guī)律以及增殖速度。
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