3討論
3.1RdrA對(duì)F44菌株耐酸性能的影響
對(duì)F44、△rdrA和FrdrA菌株的酸耐受等表型試驗(yàn)得出，△rdrA菌株耐酸性能極顯著提升，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子RdrA影響酸應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動(dòng)，抑制F44菌株的酸耐受能力。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌F44中轉(zhuǎn)錄因子YthA參與ADI途徑，促進(jìn)精氨酸生物合成和極性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，以此提升菌株酸耐受能力。乳酸乳球菌NZ9000中轉(zhuǎn)錄因子LssR通過(guò)上調(diào)ADI通路和表面多糖生物合成通路中的部分基因表達(dá)，幫助菌株響應(yīng)酸脅迫。研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)耐酸性能的影響有助于進(jìn)一步解析乳酸菌的耐酸機(jī)制。
3.2RdrA對(duì)F44菌株酸脅迫響應(yīng)的研究
3.2.1RdrA對(duì)細(xì)胞壁合成與修飾的影響
如表4所示，相較于F44原始菌株，△rdrA菌株中plpA、plpB、plpC基因轉(zhuǎn)錄量分別上調(diào)1.04、1.23、1.24倍。根據(jù)KEGG代謝通路注釋，它們均屬于MetQ家族，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MetNIQ)中的底物結(jié)合蛋白(Substrate-bindingprotein,SBP)。這些蛋白位于細(xì)胞膜或跨膜結(jié)構(gòu)域上，通過(guò)特異性識(shí)別D-蛋氨酸及其衍生物，使跨膜域構(gòu)象改變，從而完成底物向胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程。
研究表明，細(xì)菌可以通過(guò)利用D-蛋氨酸修飾細(xì)胞壁肽聚糖，以此促進(jìn)菌株酸耐受能力。在大腸桿菌、棒狀桿菌、植物乳桿菌等多種細(xì)菌中，D-蛋氨酸能夠替代細(xì)胞壁肽聚糖部分位點(diǎn)的原有氨基酸，修飾細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)。在乳酸乳球菌F44中，D-蛋氨酸可以替換至肽聚糖胞壁肽的第5位，并且通過(guò)這種細(xì)菌細(xì)胞壁修飾作用提高菌株在酸脅迫環(huán)境下的存活率和Nisin產(chǎn)量。
在△rdrA菌株中，細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)D-蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，以適應(yīng)或補(bǔ)償由于RdrA缺失造成的生理變化。轉(zhuǎn)錄因子RdrA通過(guò)下調(diào)D-蛋氨酸向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)水平，抑制細(xì)胞壁的合成與修飾過(guò)程，進(jìn)而降低乳酸乳球菌F44的酸耐受和Nisin耐受能力。
3.2.2RdrA對(duì)氨基酸合成與代謝的影響
如表4所示，△rdrA菌株中cysD基因轉(zhuǎn)錄量上調(diào)1.01倍。根據(jù)KEGG代謝通路注釋，cysD編碼O-乙酰高絲氨酸巰基酶(O-acetylhomoserinesulfhydrylase)。在谷氨酸棒狀桿菌中，氧-乙酰-高絲氨酸(O-Acetyl-L-homoserine)和甲硫醇(Methanethiol)經(jīng)MetY(CysD同源蛋白)催化生成蛋氨酸和醋酸鹽。這一途徑相較于由天冬氨酸合成蛋氨酸的途徑，需要的NADPH水平較低，而且不需要最終的甲基化過(guò)程，減少了碳流失。
有研究指出，在酸性環(huán)境下，提高植物乳桿菌胞內(nèi)的蛋氨酸水平，不僅可以降低同型半胱氨酸積累產(chǎn)生的毒性作用，還可以提高細(xì)胞膜中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，從而增強(qiáng)植物乳桿菌細(xì)胞的酸耐受能力。
這些發(fā)現(xiàn)表明，轉(zhuǎn)錄因子RdrA通過(guò)降低O-乙酰高絲氨酸巰基酶的合成水平來(lái)抑制蛋氨酸合成途徑，致使細(xì)胞毒性累積及細(xì)胞膜的飽和脂肪酸比例失調(diào)，進(jìn)而降低乳酸乳球菌F44酸耐受能力。
3.2.3RdrA對(duì)DNA修復(fù)的影響
如表4所示，△rdrA菌株中DYH_g1322基因轉(zhuǎn)錄量上調(diào)1.67倍。DYH_g1322被eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋為DNA重組修復(fù)蛋白R(shí)ecT編碼基因。RecT參與同源重組過(guò)程，對(duì)修復(fù)DNA損傷，維持基因組穩(wěn)定起到關(guān)鍵作用。在大腸桿菌中，RecET構(gòu)成一種同源重組途徑，外切酶VIII(recE編碼)以5'-3'的方向降解線性雙鏈DNA，暴露單鏈DNA后由RecT蛋白介導(dǎo)完成同源重組，促進(jìn)修復(fù)斷裂的雙鏈DNA。Zhu等發(fā)現(xiàn)，在乳酸乳球菌NZ9000中過(guò)表達(dá)來(lái)自大腸桿菌MG1655和乳酸乳球菌A76的recT基因可以提高NZ9000菌株在乳酸、鹽和乙醇脅迫下的耐受能力以及細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷濃度，表明酸應(yīng)激條件下RecT蛋白表達(dá)量提升能夠提高菌株酸耐受能力。
因此，轉(zhuǎn)錄因子RdrA通過(guò)下調(diào)重組修復(fù)蛋白表達(dá)，抑制DNA修復(fù)途徑，進(jìn)而降低乳酸乳球菌F44酸耐受能力。
3.2.4RdrA對(duì)蛋白修飾的影響
如表4所示，△rdrA菌株中yhjG基因轉(zhuǎn)錄量上調(diào)1.01倍。根據(jù)eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，yhjG編碼蛋白N-乙?；D(zhuǎn)移酶(ProteinN-acetyltransferase)。有研究指出，在結(jié)核分枝桿菌mc(2)155中，rimI基因(與yhjG基因具有同源性)的過(guò)表達(dá)可以顯著提升菌株的酸耐受性以及對(duì)其他多種環(huán)境脅迫的耐受能力。
△rdrA菌株酸耐受性增強(qiáng)可能與yhjG基因表達(dá)量的上調(diào)有關(guān)。N-乙?；且环N重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，這種修飾可能通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，或通過(guò)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和降解速率，來(lái)幫助細(xì)菌適應(yīng)酸性環(huán)境。這一發(fā)現(xiàn)為理解細(xì)菌如何通過(guò)翻譯后修飾來(lái)適應(yīng)環(huán)境壓力提供了新的視角。
3.2.5RdrA對(duì)F44菌株耐酸性能的影響
通過(guò)分析顯著差異表達(dá)基因功能，總結(jié)了RdrA影響耐酸性能示意圖，如圖7所示。RdrA主要通過(guò)抑制D-蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白(PlpA、PlpB、PlpC)的表達(dá)，降低細(xì)胞被膜的穩(wěn)定性，從而使F44菌株對(duì)酸脅迫和Nisin脅迫的耐受能力下降。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子RdrA還通過(guò)降低O-乙酰高絲氨酸巰基酶(CysD)、DNA重組修復(fù)蛋白(DYH_g1322)和蛋白N端乙?；D(zhuǎn)移酶(YhjG)的表達(dá)水平，抑制蛋氨酸合成、DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)翻譯后修飾這些細(xì)胞關(guān)鍵生理過(guò)程的活性。這些發(fā)現(xiàn)為理解RdrA在細(xì)菌耐酸調(diào)控中的作用提供了新的見(jiàn)解，并為未來(lái)提高工業(yè)生產(chǎn)菌株的耐酸性提供了潛在的分子靶點(diǎn)。
圖7轉(zhuǎn)錄因子RdrA影響耐酸性能示意圖
4結(jié)論
研究揭示了乳酸乳球菌F44中與耐酸性能相關(guān)的DeoR/GlpR家族轉(zhuǎn)錄因子RdrA的作用。rdrA突變并不影響菌株生長(zhǎng)情況，然而在pH3.0的酸性環(huán)境下，rdrA缺陷型菌株的細(xì)胞存活率極顯著提高，并且增強(qiáng)Nisin耐受性能。轉(zhuǎn)錄組分析和qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子RdrA抑制了D-蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白表達(dá)，降低了O-乙酰高絲氨酸巰基酶表達(dá)水平，抑制了DNA分子修復(fù)和蛋白修飾過(guò)程，使乳酸乳球菌F44耐酸能力下調(diào)。此外，RdrA削弱細(xì)胞被膜的流動(dòng)性和韌性，降低了F44菌株對(duì)Nisin脅迫的耐受能力。對(duì)RdrA潛在的調(diào)控靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，有助于完善乳酸乳球菌的酸耐受機(jī)制，為理解乳酸菌如何在酸性環(huán)境中維持穩(wěn)定性和功能性提供新的視角，助力進(jìn)一步改造發(fā)酵工業(yè)菌株。
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