為了分離出可用于研發(fā)驢用微生態(tài)制劑的乳酸桿菌，采集健康驢新鮮糞樣4份，通過分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、培養(yǎng)特性篩選出革蘭氏陽(yáng)性，厭氧，無(wú)芽孢桿菌1株。通過生理生化鑒定和PCR鑒定，確定該分離菌株為干酪乳桿菌，編號(hào)為L(zhǎng)V1。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，干酪乳桿菌LV1安全，無(wú)致病性，適宜生長(zhǎng)溫度范圍為30～40℃，培養(yǎng)液初始pH3～8條件下均能生長(zhǎng)。研究為研發(fā)驢用乳酸桿菌微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。
驢是草食家畜，飼草為主要日糧，飼喂量不足或飼喂質(zhì)量較差的飼草將影響驢消化系統(tǒng)功能、機(jī)體健康和生產(chǎn)性能，制約驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。
乳酸桿菌（Lactic acid bacteria，LAB）是動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群和常在菌群，可發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸、消化酶、維生素、抑菌物質(zhì)等代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)菌群平衡，增強(qiáng)免疫力。通過乳酸桿菌的發(fā)酵作用，將富含粗纖維的農(nóng)作物秸稈，轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)質(zhì)的驢用生物發(fā)酵粗飼料，替代飼草粗飼料，在提高驢生產(chǎn)性能同時(shí)緩解飼草缺乏壓力，促進(jìn)生物質(zhì)資源利用。
研究擬從健康驢腸道內(nèi)分離乳酸桿菌，研究其生物學(xué)特性，為研發(fā)驢用微生態(tài)制劑和驢用生態(tài)飼料，促進(jìn)驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品來(lái)源
前往黑龍江省三頭驢農(nóng)業(yè)科技有限公司種驢繁育基地，無(wú)菌采集健康驢新鮮糞便4份，冷藏并迅速送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。
1.1.2培養(yǎng)基
MRS肉湯和MRS瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，用于乳酸桿菌分離培養(yǎng)。
1.1.3主要試劑
細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。
1.2方法
1.2.1樣品處理
將無(wú)菌采集的健康驢新鮮糞樣置于盛有50 mL滅菌生理鹽水含玻璃珠的錐形瓶中。將錐形瓶置于搖床，180 r·min-1振蕩5 min，然后進(jìn)行10倍系列稀釋，自10-1至10-9，共9個(gè)稀釋度。
1.2.2菌株分離、染色和鏡檢
分別取適宜稀釋度的糞樣混懸液0.1 mL涂布于MRS平板，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24～48 h。挑取各種不同菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌體形態(tài)。
1.2.3菌株的純化
挑取MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上的疑似菌落進(jìn)行純化，純化好的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并描述各菌株的菌落形態(tài)特征。
1.2.4乳酸桿菌生化鑒定
依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌的分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中乳酸桿菌屬和種的生理生化鑒定指標(biāo)，首先通過厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，過氧化氫酶試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，初步確定乳酸桿菌屬。再通過糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，包括葡萄糖、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、松三糖、核糖、木糖、蔗糖、葡萄糖酸鹽、甘露醇、山梨醇、七葉苷、水楊素等，以確定乳酸桿菌種。
1.2.5乳酸桿菌PCR鑒定
提取菌株LV1基因組DNA，采用干酪乳桿菌16S rDNA鑒定引物，上游引物P1：5’-TGGTCGGC AGAGTAACTGTTGTCG-3’，下游引物P2：5’-CCAC CTTCCTCCGGTTTGTCA-3’，擴(kuò)增片段大小為727 bp，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25μL）：PCR Premix 12.5μL，P1、P2各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 10.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火復(fù)性40 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。
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