2 結(jié)果與分析
2.1 革蘭氏染色形態(tài)學(xué)分析
據(jù)觀察，W. cibaria BWL4的菌落形態(tài)呈現(xiàn)出中間凸起的光滑乳白色的小圓點(diǎn)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌體多以成對(duì)或單個(gè)短棒狀出現(xiàn)，大小略有區(qū)別。
革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色或藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。W. cibaria BWL4的革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌落呈現(xiàn)紫色，由此可判斷W. cibaria BWL4為革蘭氏陽(yáng)性菌。
2.2 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線
W. cibaria BWL4的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸規(guī)律如圖所示。從生長(zhǎng)曲線可以看出，W. cibaria BWL4在接種2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在16 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，48 h時(shí)的A???值達(dá)到2.4左右。
從產(chǎn)酸曲線可以看出：當(dāng)W. cibaria BWL4處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，培養(yǎng)基的pH值快速下降；處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)，其pH值也逐漸趨于穩(wěn)定，pH值保持在3.9左右。
2.3 耐酸、耐膽鹽性能分析
W. cibaria BWL4中加入不同濃度鹽酸和不同體積分?jǐn)?shù)牛膽鹽時(shí)的生長(zhǎng)情況如圖所示。圖中：1為對(duì)照組；2、3、4分別對(duì)應(yīng)pH值為4.0、3.0、2.5；5、6、7分別對(duì)應(yīng)加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%的牛膽鹽。W. cibaria BWL4在不同pH值和牛膽鹽體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)24 h時(shí)A???值見表1所列。
表1 W. cibaria BWL4在不同pH值和（牛膽鹽）時(shí)A???值
組別 pH值 牛膽鹽體積分?jǐn)?shù)/%
對(duì)照 2.5 3.0 4.0 0.1 0.2 0.3
測(cè)定1 2.313 0.087 0.476 1.759 1.280 0.713 0.098
測(cè)定2 2.309 0.079 0.482 1.818 1.302 0.737 0.097
測(cè)定3 2.318 0.083 0.473 1.798 1.296 0.725 0.098
由表1可知：與對(duì)照組比較，W. cibaria BWL4在不同pH值下生長(zhǎng)均受到抑制，在pH值為4.0時(shí)，其A???為1.792左右，這與已報(bào)道的植物乳桿菌C182、腸系膜明串菌株C10、F27、C4在培養(yǎng)基pH值為4.0時(shí)A???均不超過1.4相比較，其耐受能力最好；當(dāng)pH值為3.0時(shí)，植物乳桿菌C182、腸系膜明串菌株C4、F27的生長(zhǎng)狀況不及W. cibaria BWL4菌株，說明W. cibaria BWL4的耐酸性能更好；當(dāng)pH值為2.5時(shí)，菌株幾乎無法生長(zhǎng)，說明W. cibaria BWL4不能耐受此酸性環(huán)境。
從圖表可以看出，W. cibaria BWL4耐膽鹽性能與耐酸性能相似，在不同體積分?jǐn)?shù)牛膽鹽條件下均受到抑制，當(dāng)牛膽鹽體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，W. cibaria BWL4生長(zhǎng)良好，在0.3%的牛膽鹽條件下，W. cibaria BWL4無法耐受此膽鹽環(huán)境。
2.4 抗真菌譜分析
本文通過平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)W. cibaria BWL4對(duì)黃曲霉菌、擴(kuò)展青霉菌、灰霉菌及鐮刀菌均有抑制作用，其中菌株對(duì)灰霉菌的抑制效果最佳，對(duì)鐮刀菌的抑制最弱。
2.5 抑細(xì)菌譜分析
W. cibaria BWL4的無菌上清液對(duì)大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、丙二酸鹽克羅諾362、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制效果。
上清原液、pH值7.0的W. cibaria BWL4上清液和W. cibaria BWL4上清液。將上清液的pH值調(diào)到中性條件和單純的MRS培養(yǎng)基均無抑菌作用。
不同處理方式對(duì)指示菌的作用效果見表2所列。從表2可以看出，上清原液對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制效果最好，對(duì)沙門氏菌的效果相對(duì)較差。
表2 W. cibaria BWL4對(duì)指示菌的抑制作用
處理方式 大腸桿菌 單核細(xì)胞增生李斯特菌 丙二酸鹽克羅諾362 沙門氏菌 金黃色葡萄球菌
上清液 +++ ++++ ++++ ++ +++
pH值7.0上清液 NE NE NE NE NE
MRS培養(yǎng)基 NE NE NE NE NE
注：NE表示無抑制作用；+表示抑菌圈直徑7~<11 mm；++表示抑菌圈直徑11~<14 mm；+++表示抑菌圈直徑14~<17 mm；++++表示抑菌圈直徑17~20 mm。
3 結(jié) 論
本實(shí)驗(yàn)通過W. cibaria BWL4對(duì)真菌的平板對(duì)峙方法發(fā)現(xiàn)，W. cibaria BWL4對(duì)黃曲霉菌、灰霉菌、擴(kuò)展青霉菌和鐮刀菌均能產(chǎn)生顯著的抑制作用，這與已報(bào)道的結(jié)果一致。本研究通過牛津杯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)W. cibaria BWL4的細(xì)胞上清液對(duì)大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、丙二酸鹽克羅諾362、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制效果，相較于已報(bào)道的植物乳桿菌DY-6的抑菌效果更為顯著。因此本文推測(cè)W. cibaria BWL4的細(xì)胞上清液中含有能夠破壞致病菌細(xì)胞完整性的活性物質(zhì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)通過多種方式來提取這些活性物質(zhì)，例如乳酸菌可以通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)來抑制病原真菌。因此后續(xù)將通過研究GC-MS檢測(cè)其產(chǎn)生的具有拮抗作用的揮發(fā)性物質(zhì)成分，進(jìn)一步完善W. cibaria BWL4的抑菌機(jī)理。
本實(shí)驗(yàn)經(jīng)分離純化出食竇魏斯氏菌W. cibaria BWL4，通過對(duì)其系統(tǒng)發(fā)育樹和生長(zhǎng)曲線的研究以及對(duì)其耐酸、耐膽鹽的性能分析，了解了W. cibaria BWL4的基本生物學(xué)特性，并采用平板對(duì)峙與牛津杯的實(shí)驗(yàn)方法探究W. cibaria BWL4的抑菌譜特性，為其對(duì)病原菌的抑制機(jī)理提供了重要信息，有助于進(jìn)一步研究其對(duì)抑制各類致病菌代謝機(jī)制。
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