分子鑒定
通過氯仿/異戊醇方法5從分離株的酵母相中提取基因組DNA(DNA)，用于部分β-微管蛋白(β-tub)和幾丁質(zhì)合酶(CHS)編碼基因的測(cè)序1，以及如所述進(jìn)行T3B聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)指紋分析43。在T3B PCR指紋分析中，對(duì)照菌株為巴西孢子絲菌(CBS120339)、墨西哥孢子絲菌(MUM11.02)、申克孢子絲菌(ATCC32286)和球形孢子絲菌(IPEC27135)。在測(cè)序分析中，巴西孢子絲菌(CBS120339)、球形孢子絲菌(FMR8600)、墨西哥孢子絲菌(CBS120341)、蒼白孢子絲菌(CBS111110)和申克孢子絲菌(FMR8604)用作來(lái)自國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公共Genbank的參考菌株。
巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
進(jìn)行了使用J774巨噬細(xì)胞的體外毒力實(shí)驗(yàn)，以確定巨噬細(xì)胞吞噬和殺死巴西孢子絲菌酵母的能力，以及這種相互作用后巨噬細(xì)胞的活力。44 J774系的巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)板中以單層生長(zhǎng)，在含有10%胎牛血清、10%NCTC-109、1%非必需氨基酸和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基用杜爾貝科改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)稀釋，在37°C，10%CO2條件下，并分到96孔板中。將5株巴西孢子絲菌分離株的酵母細(xì)胞，先前通過豚鼠血清補(bǔ)體(MP Biomedicals)孵育30分鐘進(jìn)行調(diào)理，以5:1的比例添加到巨噬細(xì)胞單層中。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
為了評(píng)估體內(nèi)毒力，使用25μL Hamilton®注射器給大蠟螟（Vanderhorst Wholesale,Inc.）幼蟲接種104、106或107個(gè)酵母細(xì)胞（五種巴西孢子絲菌分離株之一，稀釋在10μL PBS中），并分析幼蟲存活率。40作為對(duì)照，一組幼蟲接種了巴西孢子絲菌參考菌株(CBS120339)。陰性對(duì)照組包括未接種的幼蟲（“Control”）和注射10μL無(wú)菌PBS的幼蟲（“PBS”）。這些實(shí)驗(yàn)在不同日期進(jìn)行了三次重復(fù)。每組由20只幼蟲組成，在90 mm培養(yǎng)皿中于37°C下維持，并每天評(píng)估大蠟螟。在0天（接種日）和2天（接種后48小時(shí)）對(duì)組進(jìn)行拍照（Canon EOS DIGITAL REBEL）。死亡幼蟲（通過缺乏主動(dòng)或觸摸誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)且通常顏色變黑來(lái)識(shí)別）從組中移除并丟棄。獲得生存曲線以比較分離株對(duì)幼蟲的影響。
在相同條件下，每組10只幼蟲的平行組用于CFU測(cè)定。在接種后3天或6天，處死每組3只幼蟲。將內(nèi)部?jī)?nèi)容物研磨并在2 mL PBS中勻漿，然后通過40μm細(xì)胞過濾器過濾。取100μL這種勻漿液鋪在含有0.4 g/L放線菌酮和1%青霉素/鏈霉素的BHI瓊脂上以防止污染，并在37°C下孵育。五天后，測(cè)定CFU。
體外推定毒力因子的產(chǎn)生
a.脲酶
為了驗(yàn)證脲酶產(chǎn)量，將每種分離株相當(dāng)于2.0 McFarland比濁度的酵母細(xì)胞懸浮液0.5 mL接種到4.5 mL Christensen尿素肉湯中，45,46并在37°C下孵育。四天和七天后，將試管以1,575 g離心（Centrifuge 5804R,Eppendorf），并將100 uL上清液一式三份轉(zhuǎn)移到96孔聚苯乙烯平底板（Corning,Tewksbury,USA）中。新型隱球菌(ATCC32045)和近平滑念珠菌(ATCC22019)分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。使用Biotek分光光度計(jì)（Epoch型號(hào)）在559 nm波長(zhǎng)下獲得樣品吸光度(O.D.)。
b.蛋白酶
蛋白酶活性按描述測(cè)量，使用以下混合物：2%瓊脂，15 mM葡萄糖，13 mM甘氨酸，29.4 mM KH2PO4，10 mM MgSO4，3 mM硫胺素，0.1%azoalbumin(pH 4.5)。對(duì)于蛋白質(zhì)瓊脂清除，每種分離株的酵母細(xì)胞通過穿刺接種在該混合物上，并在37°C下孵育21天。孵育后，檢查菌落周圍是否產(chǎn)生azoalbumin降解暈圈。當(dāng)觀察到蛋白水解活性時(shí)，用毫米尺測(cè)量菌落直徑(p)和azoalbumin降解暈圈直徑(z)，并計(jì)算p/z值作為兩個(gè)直徑的比率。
c.黑色素
根據(jù)Almeida-Paes等人描述的方法獲得黑色素“幽靈”。48然后通過簡(jiǎn)單的DHN-黑色素/酵母干重比(w/w)計(jì)算每種分離株的二羥基萘(DHN)-黑色素比例。
耐熱性
每種5株分離株的酵母在37°C的BHI肉湯中生長(zhǎng)，3天后，將2 mL酵母溶液離心，重懸于PBS中，并進(jìn)行10倍稀釋以獲得3種不同的稀釋度。將2.5μL滴液接種在BHI瓊脂平板上，并在35、37或39°C的37900型培養(yǎng)箱中孵育。三天和六天后，定性驗(yàn)證平板以確定是否存在菌落生長(zhǎng)。
生長(zhǎng)曲線
5株分離株的巴西孢子絲菌酵母細(xì)胞在BHI肉湯(Difco)中于37°C生長(zhǎng)3天。根據(jù)Medina等人描述的方法稍作修改，使用Bioscreen C微生物生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)（Labsystems,Helsinki,Finland）連續(xù)評(píng)估濁度作為生長(zhǎng)的量度。使用制造商提供的Easy Bioscreen Experiment(EZExperiment)軟件記錄數(shù)據(jù)。
對(duì)氧化劑的敏感性
每種分離株的真菌細(xì)胞（1 x 10<sup>7</sup>個(gè)酵母）在37°C的BHI瓊脂斜面上生長(zhǎng)5天后收獲，用PBS洗滌3次，并提交給化學(xué)生成的一氧化氮、活性氮中間體和氧源性氧化劑，如先前所述。<sup>15</sup>在37°C下與氧化劑孵育1、2、3和4小時(shí)后，將酵母鋪在平板計(jì)數(shù)瓊脂（Bio-Rad）上，通過CFU計(jì)數(shù)確定存活率。未經(jīng)處理的細(xì)胞等分試樣也作為對(duì)照鋪板。某個(gè)時(shí)間點(diǎn)每種分離株的存活率是該時(shí)間點(diǎn)的CFU計(jì)數(shù)/對(duì)照CFU計(jì)數(shù)的比率，以百分比表示。
抗真菌藥敏試驗(yàn)
根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)方案，使用分生孢子進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用CLSI描述的用于絲狀真菌（包括申克孢子絲菌）的微量稀釋法M38-A2（0.016-8μg/mL）<sup>50</sup>研究了5株分離株對(duì)兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑和特比萘芬的敏感性。將細(xì)胞在RPMI 1640中稀釋，最終濃度為2 x 10<sup>4</sup>至1 x 10<sup>5</sup>個(gè)細(xì)胞/mL。對(duì)于兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑，最低抑菌濃度(MIC)終點(diǎn)是產(chǎn)生完全生長(zhǎng)抑制的最低濃度。對(duì)于酮康唑，MIC是導(dǎo)致生長(zhǎng)減少50%的最低濃度，對(duì)于特比萘芬，它是導(dǎo)致生長(zhǎng)減少至少80%的最低濃度。
統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)
在分析中使用了非參數(shù)檢驗(yàn)（例如，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較生長(zhǎng)曲線和CFU，Kaplan-Meier估計(jì)量用于大蠟螟的存活率，Log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)用于比較生存曲線）來(lái)比較5株分離株，P值<0.05被認(rèn)為是顯著的。使用GraphPad Prism 6 for Windows,GraphPad Software,Inc.進(jìn)行圖表構(gòu)建和統(tǒng)計(jì)。使用Microsoft Excel 2010/2013(Microsoft Corporation,Redmond,Washington,USA)進(jìn)行百分比計(jì)算和分析。
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