1.2 方法
1.2.1 AIH小鼠模型的建立
飼養(yǎng)ST2敲除小鼠和C57BL/6J小鼠4~6周后，ST2敲除小鼠和C57BL/6J小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射ConA（20 mg/kg），8 h后眼球取血，脊椎脫臼法處死，取肝臟。模型的構(gòu)建及驗證在課題組前期工作中已被證實。
1.2.2 血清 ALT及AST測定
4 ℃、12 000 r/min、離心5 min血液2次后，取血清，采用酶比色法在德國羅氏公司cobas 702全自動生化分析儀測定小鼠血清ALT及AST濃度。
1.2.3 肝臟病理HE染色
從處死的小鼠中取肝臟組織約50 mg并固定在10%磷酸鹽緩沖甲醛中。然后將樣品轉(zhuǎn)移至不同濃度的乙醇和二甲苯中。切片嵌入石蠟并進行HE染色。載玻片制備如下：載玻片用1%甲苯胺藍復(fù)染5 min，并用蒸餾水洗滌，然后使用分級系列乙醇洗滌脫水。加入血紅素溶液，用水和鹽酸乙醇洗滌后將載玻片維持5 min。然后將切片在37 ℃下用伊紅溶液染色5 min，用乙醇脫水并浸入二甲苯中。最后，將載玻片安裝在玻璃蓋玻片下，并在光學(xué)顯微鏡下進行觀察及拍照。
1.2.4 實時熒光定量PCR（RT-PCR）分析
使用苯酚-氯仿法抽提取小鼠肝臟的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：在總RNA樣本中加入Oligo（dT）引物后充分混勻，PCR儀65 ℃擴增5 min；待反應(yīng)完成后按試劑說明書加入dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑等，在PCR儀上42 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃反應(yīng)5 min后4 ℃保存。目標基因表達水平的檢測采用SYBR Green法，以cDNA為模板，擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；隨后95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，重復(fù)40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達水平。
1.2.5 腸道菌群測序
根據(jù)試劑盒說明書，采用QIAamp® DNA Stool Mini Kit提取小鼠腸道糞便的總基因組DNA，使用16S rRNA通用引物338F（5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGA- CTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進行擴增。純化后的擴增產(chǎn)物使用MiSeq測序儀進行測序。
1.2.6 腸道菌群多樣性分析
測序結(jié)果采用Microbial Ecology相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫進行分析，包括Prinseq、FLASH、PEAR、Mothur、Usearch、Cytoscape、R和RDP classifier等軟件，RDP、Silva和NCBI 16S database等數(shù)據(jù)庫。Chao、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)由Mothur軟件計算產(chǎn)生。菌屬多樣性分析采用RDP classifier分析軟件。菌群分布采用STAMP軟件分析。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析
采用Graphad Prism 8.0軟件作圖。采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用
±s表示，組間資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，以雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 敲除ST2基因表達可減輕ConA誘導(dǎo)的肝炎小鼠肝損傷和炎癥
采用ConA將敲除ST2基因小鼠（ST2-/-組）和C57BL/6J小鼠（Control組）誘導(dǎo)成AIH小鼠。結(jié)果顯示與對照組相比，敲除ST2基因小鼠血清中ALT和AST水平降低（P<0.05，圖1A）。同時，對小鼠肝臟進行HE染色，染色結(jié)果顯示肝臟呈現(xiàn)典型的界面性肝炎、淋巴細胞浸潤，符合ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠模型，并且發(fā)現(xiàn)敲除ST2基因的小鼠肝臟病理損傷較輕（圖1B）。最后，對小鼠肝臟中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ等基因的相對表達量進行檢測，結(jié)果顯示敲除ST2基因表達后IL-6的表達量降低（P<0.001，圖1C），其他細胞因子表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
圖1 敲除ST2基因表達可減輕ConA誘導(dǎo)的肝炎小鼠肝損傷和炎癥
2.2 腸道菌群豐度和α多樣性分析
采用ACE、Chao、Richness、Shannon和Simpson指數(shù)對小鼠腸道菌群的豐度和α多樣性進行分析，結(jié)果顯示ACE、Chao、Richness、Shannon和Simpson指數(shù)在Control組和ST2-/-組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A~J）。表明在AIH小鼠體內(nèi)敲除ST2基因表達不影響腸道菌群的分布豐度及α多樣性。
圖2 小鼠腸道菌群豐度和α多樣性分析
2.3 腸道菌群β多樣性分析及LEfSe分析
利用PCA對小鼠腸道菌群的β多樣性進行分析，結(jié)果顯示，Control組和ST2-/-組小鼠腸道菌群的物種組成無明顯差異（圖3）。LEfSe分析可以檢測到各組小鼠腸道有顯著差異的菌群，如圖4A、B，設(shè)定LDA值為4進行LEfSe分析可得Clostridia、Clostridiales、Lachnospiraceae、unclassified_Lachnospiraceae、BacillalesStaphylococcus、Staphylococcaceae、Saccharibacteria_ genera_incertae_sedis、norank_Candidatus_Saccharibacteria、norank_Candidatus_Saccharibacteria、Candidatus_Saccharibacteria、norank_Candidatus_Saccharibacteria、unclassified_Clostridiales、unclassified_Clostridiales和Clostridium_XVIII在Control組和ST2-/-組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
圖3 腸道菌群PCA分析圖
圖4 腸道菌群LEfSe分析
2.4 腸道菌群種屬差異分析
為進一步觀察ST2敲除后對哪些菌群產(chǎn)生影響，對小鼠腸道菌群的種屬差異進行分析。結(jié)果顯示，正常小鼠誘導(dǎo)的肝炎小鼠腸道菌群中占主要的菌屬是unclassified_Porphyromonadaceae（22.02%）、Akkermansia（17.87%）和Lactobacillus（14.81%）（圖5A），而ST2敲除小鼠誘導(dǎo)的肝炎小鼠腸道菌群中占主要的菌屬是unclassified_Lachnospiraceae（25.36%）unclassified_Porphyromonadaceae（21.82%）、Akkermansia（12.07%）（圖5B）。Psychrobacter（P=0.045）、Romboutsia（P=0.037）、Rikenella（P=0.036）、unclassified_Clostridia（P=0.030）、Halothiobacillus（P=0.028）、Parabacteroides（P=0.025）、Clostridium_XlVa（P=0.024）、Haemophilus（P=0.018）和unclassified_Clostridiales（P=9.40e-3）菌屬在Control組和ST2-/-組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6）。
圖5 小鼠腸道菌屬分布
圖6 腸道菌屬分布差異圖
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