摘要
目的
通過敲除生長刺激表達基因2（ST2）表達探討其對ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎（AIH）小鼠腸道菌群的影響。
方法
借助基因敲除技術(shù)，構(gòu)建ST2基因敲除小鼠，在此基礎(chǔ)上采用ConA誘導(dǎo)建立AIH小鼠模型；通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細胞因子相對表達量；使用16S rRNA高通量測序方法進行腸道微生物測序，測序結(jié)果采用Microbial Ecology相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫進行分析。
結(jié)果
與對照組相比，在敲除ST2基因后，ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠血清中ALT和AST水平降低，肝臟損傷較輕且IL-6相對表達量也降低；反應(yīng)菌群分布豐度的ACE和CHAO指數(shù)無明顯差異；反映菌群多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)無明顯差異；Psychrobacter、unclassified_Clostridia、Halothiobacillus、Clostridium_XlVa和Haemophilus菌屬含量增加；Romboutsia、Rikenella、Parabacteroides和unclassified_Clostridiales菌屬含量減低，其受試者工作特征（ROC）曲線下面積分別為0.88、0.89、0.88、0.80、0.90、0.90、0.84、0.91和0.84。
結(jié)論
在AIH小鼠體內(nèi)敲除ST2基因表達可減輕肝損傷及炎癥，不影響腸道菌群的分布豐度及多樣性，但菌屬間具有差異性，且具有良好的診斷價值。
自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種以血清自身抗體陽性、高免疫球蛋白G和或γ球蛋白血癥、肝組織學(xué)上存在界面性肝炎的肝臟實質(zhì)性炎癥。多項研究提示腸道微生態(tài)在AIH發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其機制有分子模擬、腸屏障破壞、淋巴細胞歸巢等。最新研究表明AIH患者糞便菌群結(jié)構(gòu)與功能的改變，提示腸道菌群作為非侵入性生物標(biāo)志物用于評估疾病活動度的潛在可能性；另有研究人員發(fā)現(xiàn)益生菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群和腸道通透性來抑制促炎因子的釋放從而緩解小鼠AIH，這些研究均表明腸道菌群是AIH發(fā)生發(fā)展的重要因素。IL-33是近年來發(fā)現(xiàn)屬于IL-1家族中的一種新型炎癥因子，在過敏反應(yīng)、寄生蟲感染、癌癥、組織纖維化、慢性炎癥、器官移植和風(fēng)濕性免疫疾病中的發(fā)揮重要作用。IL-33受體復(fù)合物是由IL-1受體附屬蛋白（IL-1RACP）和IL-1受體1型（IL1R1）編碼的ST2組成的異二聚體復(fù)合物。有研究表明IL-33/ST2可能在AIH的發(fā)病機制和嚴重程度中發(fā)揮重要作用，是治療AIH的重要靶點，但其具體作用機制仍有待研究。IL-33/ST2在AIH中的作用是否與腸道菌群有關(guān)呢？本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)蛋白CCN1可通過上調(diào)IL-6的產(chǎn)生促進AIH的炎癥反應(yīng)。本研究將進一步探討影響AIH發(fā)病的可能因素，首先擬通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建ST2敲除小鼠，經(jīng)刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導(dǎo)小鼠成為AIH小鼠后，采用RT-PCR、16S rRNA高通量測序和微生物多樣性分析等方法探討敲除ST2表達對AIH小鼠腸道菌群的影響，以期為闡明IL-33/ST2在AIH發(fā)病中的作用，完善AIH的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
50只C57BL/6J小鼠（體質(zhì)量18~20 g，5周齡）購自上海斯萊克公司；ST2敲除小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈；小鼠實驗經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審定，通過動物實驗倫理審查。
1.1.2 主要試劑與儀器
ConA購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；SYBR GreenPremix Ex Taq PCR試劑購自日本TaKaRa公司；cobas 702全自動生化分析儀購自德國羅氏公司，PCR引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。
表1 基因引物序列
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