摘要：腸道微生物群在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。然而，腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物參與膿毒癥過程的具體機(jī)制仍不清楚，這限制了其轉(zhuǎn)化應(yīng)用。本文采用微生物組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)入院的膿毒癥患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行分析，篩選出可能對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸起重要作用的微生物群、代謝物和潛在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。最后，通過對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型的微生物組和轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。膿毒癥患者表現(xiàn)出共生菌群破壞和腸球菌豐度增加，擬桿菌（尤其是普通擬桿菌）負(fù)擔(dān)較重的患者，APACHE II評(píng)分更高，且ICU停留時(shí)間更長(zhǎng)。CLP大鼠腸道轉(zhuǎn)錄組表明，腸球菌和擬桿菌與差異表達(dá)基因具有不同的相關(guān)性，表明這些細(xì)菌在膿毒癥中的作用截然不同。此外，與健康對(duì)照組相比，膿毒癥患者的腸道氨基酸代謝紊亂，其中，色氨酸代謝與微生物群改變和膿毒癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)。腸道微生物和代謝特征的改變與膿毒癥的進(jìn)展相一致，有助于預(yù)測(cè)膿毒癥早期患者的臨床結(jié)果，并為探索新的治療方法提供轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)。
研究背景：膿毒癥是一種嚴(yán)重感染導(dǎo)致宿主劇烈炎癥反應(yīng)的疾病，是一種全球范圍內(nèi)危及生命的疾病。在某些情況下，膿毒癥會(huì)發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，導(dǎo)致預(yù)后惡化。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)與膿毒癥等多種疾病的發(fā)病機(jī)制之間存在密切的相互作用。先前很多研究主要關(guān)注膿毒癥患者的微生物特征，但在膿毒癥中發(fā)生改變的細(xì)菌作用機(jī)制仍不清楚。膿毒癥的代謝特征已在血清中確定，但膿毒癥期間腸道的代謝變化尚不清楚。膿毒癥的代謝特征已在血清中確定，但期間腸道的代謝變化尚不明確。因此，為了闡明膿毒癥中腸道微生物群和代謝物的組成及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系，我們對(duì)重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)收治的膿毒癥患者進(jìn)行了一項(xiàng)觀察性隊(duì)列研究。入院時(shí)收集的糞便樣本用于生成微生物和代謝譜。此外，我們還建立了膿毒癥大鼠模型，以反映腸道基因表達(dá)特征并驗(yàn)證患者的微生物特征。這項(xiàng)研究將揭示膿毒癥相關(guān)菌群的潛在生物學(xué)功能，為更早地預(yù)測(cè)和改善這種危險(xiǎn)疾病提供理論基礎(chǔ)。
整體研究思路
研究方法
研究設(shè)計(jì)和樣本收集
本研究為描述性觀察性研究，研究對(duì)象為來自中國(guó)一家中心（上海）的患者。膿毒癥的定義符合第三屆國(guó)際膿毒癥和感染性休克共識(shí)（spesis 3）的建議。排除患有絕癥的以及接受結(jié)腸造口術(shù)或回腸造口術(shù)的患者。經(jīng)過測(cè)序質(zhì)量過濾后，在微生物群比較中納入了38名膿毒癥患者和19名HC（圖1A）。對(duì)驗(yàn)證組的代謝組進(jìn)行單獨(dú)分析，僅在該組中檢測(cè)到的功能差異代謝物被確定為膿毒癥相關(guān)代謝物,只有在驗(yàn)證組中確認(rèn)的顯著相關(guān)性才被定義為可靠的相關(guān)性（圖1B、C）。
樣本采集和處理
排便后立即采集患者的糞便樣本，-20°C冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80°C冰箱中長(zhǎng)期保存。每份樣本分成兩部分：一部分通過16S rRNA測(cè)序進(jìn)行腸道微生物組分析，另一部分通過非靶向液相色譜-質(zhì)譜分析（LC/MS）進(jìn)行腸道代謝組學(xué)分析。
CLP模型和RNA測(cè)序
在麻醉大鼠上建立CLP膿毒癥模型，用1.5%戊巴比妥麻醉大鼠（0.5 mL/100 g體重），在腹部正中做2.5 cm的切口。在距盲腸末端1.5 cm處結(jié)扎，用14號(hào)針頭穿刺兩次。將盲腸放回腹腔后關(guān)閉腹壁。假手術(shù)大鼠接受相同程序，但不結(jié)扎和穿刺。在膿毒癥誘導(dǎo)24小時(shí)后，所有大鼠均被殺死。收集含有糞便的結(jié)腸段，立即儲(chǔ)存在?80°C，隨后用于16S RNA測(cè)序以檢測(cè)腸道。此外，收集從大鼠固定位置取下的遠(yuǎn)端回腸和結(jié)腸組織，用生理鹽水輕輕沖洗，儲(chǔ)存在-80°C用于轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
臨床指標(biāo)
結(jié)果連續(xù)變量以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量以頻率和百分比表示。使用學(xué)生t檢驗(yàn)比較年齡和ICU住院時(shí)間的差異。通過Fisher精確檢驗(yàn)比較APACHE II評(píng)分≥18、SOFA評(píng)分≥10和ICU住院天數(shù)≥30的比例以及腸型之間的病死率。這些分析通過GraphPad Prism 9進(jìn)行分析。
腸道微生物群
使用t檢驗(yàn)在操作分類單元(OTU)水平比較腸道菌群的alpha多樣性(Shannon和Chao指數(shù))。進(jìn)行Bray–Curtis距離度量的主坐標(biāo)分析(PCoA)以反映每個(gè)樣本的微生物結(jié)構(gòu)，并通過相似性分析(ANOSIM)檢驗(yàn)揭示差異。為了評(píng)估協(xié)變量對(duì)膿毒癥患者菌群的潛在影響，我們通過IBM SPSS Statistics 24.0使用學(xué)生t檢驗(yàn)或Wilcoxon檢驗(yàn)比較各組的Shannon指數(shù)、主成分(PC)1和PC2、腸球菌OTU808載量和擬桿菌OTU773載量。從科水平到OTU水平評(píng)估線性判別分析效應(yīng)大小(LEfSe)，并在不同條件下設(shè)置不同的線性判別分析(LDA)評(píng)分閾值。使用Wilcoxon檢驗(yàn)對(duì)各組間優(yōu)勢(shì)分類群進(jìn)行比較，使用Spearman相關(guān)性分析OTU豐度與臨床參數(shù)或基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，通過多元線性回歸分析OTU773相對(duì)豐度與ICU住院天數(shù)之間的相關(guān)性。
腸道代謝物
進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)和倍數(shù)變化分析?；赩IP和Wilcoxon檢驗(yàn)的p值(VIP的閾值>1，p<0.05)選擇具有顯著差異的代謝物，使用主成分分析(PCA)評(píng)估樣本的交互驗(yàn)證。通過搜索京都基因和基因組百科全書(KEGGhttp://www?；蚪M。jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù)來確定差異代謝物的生化途徑，并根據(jù)其途徑參與度進(jìn)行分類。根據(jù)功能節(jié)點(diǎn)中代謝物的存在進(jìn)行富集分析。Scipy.stats Python包用于檢驗(yàn)由Fisher精確檢驗(yàn)確定的富集途徑的統(tǒng)計(jì)顯著性。采用Spearman相關(guān)性分析來闡明代謝物豐度、細(xì)菌負(fù)荷和臨床嚴(yán)重程度指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)。此外，為了評(píng)估協(xié)變量對(duì)膿毒癥患者代謝組的潛在影響，我們使用IBM SPSS Statistics 24.0中的Student's t檢驗(yàn)比較了負(fù)模式和正模式下各組的主成分(PC)1。
腸道轉(zhuǎn)錄組
使用Edger和DESeq2 R軟件包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，并使用帶有錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率校正的Kal檢驗(yàn)。經(jīng)Benjamini-Hochberg校正后，用調(diào)整后的p值<0.05來鑒定差異表達(dá)基因(Deg)，分析DEG的功能基團(tuán)是否參與KEGG通路。生成PCA圖并用于評(píng)估其相互作用的變化。為了確定核心DEG，使用相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索工具(STRING)創(chuàng)建一個(gè)包含所有DEG的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，然后將其導(dǎo)入Cytoscape Software 3.7.0進(jìn)行可視化，選擇排名靠前的DEG進(jìn)一步行相關(guān)性分析。
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