摘要：目的：分析動物雙歧桿菌NX-6的菌株特性，并通過代謝組學(xué)結(jié)合斑馬魚模式生物探究NX-6的降脂作用機制。方法：測定并繪制NX-6生長曲線，通過場發(fā)射掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，利用人工胃液和小腸液模擬人體胃腸道環(huán)境評估NX-6的耐受性，進(jìn)一步通過全基因組學(xué)測序技術(shù)從基因?qū)用嬖u估其安全性和潛在功效，運用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測NX-6代謝活動產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，分析與降脂相關(guān)的關(guān)鍵代謝物。運用高脂飼料喂食斑馬魚建立高脂血癥模型，通過油紅O特異性脂肪染色觀察斑馬魚脂質(zhì)積累情況以研究NX-6及其關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的降脂效果，明確降脂關(guān)鍵代謝物，通過斑馬魚高脂模型評價關(guān)鍵代謝物吲哚-3-甲酸的降脂作用。結(jié)果：與對照菌株動物雙歧桿菌BB12相比，動物雙歧桿菌NX-6的人工胃腸液耐受能力更高，NX-6的基因組無毒性基因，且具有豐富的脂質(zhì)以及色氨酸代謝通路基因簇。與高脂血癥模型組相比，NX-6高度顯著降低高脂血癥斑馬魚總膽固醇與總甘油三酯的含量（P＜0.001）。與BS培養(yǎng)基相比，NX-6發(fā)酵上清液中的吲哚-3-甲酸與2-吲哚酮含量顯著增加。經(jīng)NX-6處理后，斑馬魚體內(nèi)的吲哚-3-甲酸含量高度顯著增加（P＜0.001）。吲哚-3-甲酸能高度顯著降低高脂血癥斑馬魚體內(nèi)的總膽固醇與甘油三酯含量（P＜0.001）。結(jié)論：動物雙歧桿菌NX-6通過其代謝物吲哚-3-甲酸降低高脂血癥斑馬魚模型的脂質(zhì)積累。
近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，高脂血癥已逐漸成為危害人類健康的“第一殺手”。高脂血癥是常見的脂質(zhì)代謝性疾病，主要表現(xiàn)為甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的代謝異常。目前臨床上推薦在控制飲食及保持運動的基礎(chǔ)上，多依賴他汀類藥物調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常，但長期大劑量、不合理用藥會導(dǎo)致以轉(zhuǎn)氨酶升高為特征的肝損傷和肌肉疼痛等不良反應(yīng)的發(fā)生，因此尋找更合適更健康的干預(yù)方式或輔助療法尤為重要。
益生菌是一類有益于宿主健康的活性微生物，能通過產(chǎn)生有益物質(zhì)和改變宿主腸道微生物構(gòu)成起到預(yù)防疾病或輔助治療的作用，現(xiàn)有研究證明益生菌已被廣泛應(yīng)用于增強免疫力、降血糖、抗腫瘤等方面。近年來益生菌降血脂作用的研究受到越來越多的關(guān)注，國內(nèi)外研究已經(jīng)證實一些乳酸菌（如雙歧桿菌屬、乳桿菌屬）具有降膽固醇的益生功能。動物雙歧桿菌作為一種益生菌已被證明具有多種益生功效，如Zhang Qi等研究發(fā)現(xiàn)動物雙歧桿菌乳酸亞種BL-99通過促進(jìn)機體短鏈脂肪酸調(diào)節(jié)胃泌素的分泌，從而發(fā)揮治療功能性消化不良的作用；Chantarangkul等研究發(fā)現(xiàn)動物雙歧桿菌MSMC83降低了高脂血癥大鼠模型體內(nèi)的高脂血癥相關(guān)因子（如膽固醇-7α-羥化酶和抗氧化酶）水平，從而發(fā)揮降血脂和抗氧化的作用。然而，由于大多數(shù)研究高脂血癥使用的動物模型為哺乳動物模型，包括小鼠、大鼠、兔子等，此類模型具有周期長、經(jīng)濟成本高、低通量等特點，另外雖然體外細(xì)胞模型具有高效、便捷的優(yōu)勢，但缺少體內(nèi)器官結(jié)構(gòu)，而斑馬魚作為新興的脊椎模式動物，因其具有個體小、產(chǎn)卵量多、胚胎及幼體透明等特點，且與人類基因高度同源、代謝與人類基本一致，已經(jīng)逐步成為藥物毒理研究和功能評價的模型生物，并已成功應(yīng)用于降血脂功效的研究中。Chen Sijia等通過高脂血癥斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌FA6能夠促進(jìn)乙酰輔酶A合成以改善脂質(zhì)合成和抑制β氧化影響斑馬魚體內(nèi)的脂質(zhì)代謝；Liu Yue等研究發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌PR-1可以降低高脂血癥斑馬魚體內(nèi)的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6水平，促進(jìn)Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)，調(diào)節(jié)甾體調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1、脂肪酸合酶和瘦蛋白基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗成脂活性。然而，通過高脂血癥斑馬魚模型評價動物雙歧桿菌的降血脂功效及其機制的研究較少。綜上所述，本研究對分離自健康成人糞便的動物雙歧桿菌NX-6的菌株特性進(jìn)行分析，結(jié)合代謝組學(xué)從代謝產(chǎn)物的角度分析其降脂功效的相關(guān)機制，以期為動物雙歧桿菌NX-6促進(jìn)脂肪代謝機制提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
野生型AB系斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心。斑馬魚種魚進(jìn)行胚胎繁殖后，胚胎置于斑馬魚養(yǎng)殖水（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4）中。動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）NX-6分離自健康成人糞便，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心完成菌種保藏，保藏編號：CGMCC No. 20114。
雙歧桿菌BS培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；油紅O染液、阿托伐他汀鈣三水合物、葡萄糖、1,2-丙二醇、4%多聚甲醛 上海源葉生物科技有限公司；斑馬魚魚苗正常飼料 上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司；斑馬魚高脂飼料（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%） 上海費曦生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、TG測定試劑盒 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；2-吲哚酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.49%）、吲哚-3-甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.77%） 美國MedChemexpress公司；甲醇、乙腈、甲酸 上海安譜實驗科技股份有限公司；蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；動物雙歧桿菌BB-12 丹麥Chr. Hansen公司。
1.2 儀器與設(shè)備
ZIBS-D310斑馬魚智慧養(yǎng)殖系統(tǒng) 廣東芯選檢驗檢測有限公司；SZ680連續(xù)變倍體式顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；ME203E/02電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Epoch酶標(biāo)檢測儀 美國伯騰公司；6500＋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB Sciex公司；Chemray 800全自動生化分析儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；E500厭氧工作站 美國GeneScience公司；HR40-IIA2生物安全柜 青島海爾集團；VORTEX-5渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-16K臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；AK-040SD超聲波清洗機深圳市鈺潔清洗設(shè)備有限公司；1290 Infinity II液相色譜系統(tǒng)、6545 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) 美國安捷倫科技公司；AQUITY UPLC HSS T3色譜柱 美國Waters公司；KZ-III-F高速組織研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱 貴州恩誼科技有限公司。
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