已有研究利用熒光染料HPF監(jiān)測抑菌化合物誘導的體內(nèi)熒光淬滅，我們進行了類似實驗：在添加50%MIC濃度藥物3小時后監(jiān)測HPF熒光，該濃度和時間可保證野生型和突變體菌株100%存活。結果顯示，氯霉素（圖1B）、紅霉素和四環(huán)素等抑菌化合物不會引起惡臭假單胞菌及其突變體的HPF熒光淬滅，這與大腸桿菌的實驗結果一致；野生型DOT-T1E在氨芐西林（圖1C）和諾氟沙星作用下出現(xiàn)HPF熒光淬滅。我們還檢測了T1E-18、T1E-PS28和雙突變體T1E-PS32的HPF熒光淬滅響應：100μg/mL氨芐西林即可誘導DOT-T1E-18的淬滅反應（圖1I），該濃度是野生型菌株發(fā)生淬滅所需最低濃度的1/3；雙突變體T1E-PS32在更低濃度（1/15）下即可誘導HPF熒光淬滅（圖1L）。這些結果表明，盡管基于HPF淬滅模式和親本菌株及突變體T1E-PS32的耐藥性特征，TtgGHI外排泵在氨芐西林排出中的作用較弱（圖1），但仍需將氨芐西林排出功能歸因于TtgGHI——因為ttgABC/ttgGHI雙突變體在遠低于T1E-18的氨芐西林濃度下即發(fā)生HPF熒光淬滅，且對多種抗生素的敏感性更高。
殺菌化合物并非通過產(chǎn)生活性氧殺死惡臭假單胞菌DOT-T1E
已有研究表明，體內(nèi)羥基自由基可淬滅HPF熒光；曾有觀點提出大腸桿菌中殺菌抗生素通過產(chǎn)生羥基自由基發(fā)揮普遍殺傷機制（無論其具體細胞靶點如何），依據(jù)是殺菌化合物（而非抑菌化合物）處理的細胞中會出現(xiàn)HPF熒光淬滅。但近期研究反駁了這一解釋，發(fā)現(xiàn)殺菌抗生素在無氧條件下仍可殺死大腸桿菌；與此一致，另有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌并非對所有殺菌化合物都產(chǎn)生活性氧。
我們的結果顯示，惡臭假單胞菌中殺菌和抑菌化合物引起的HPF熒光淬滅模式與上述大腸桿菌模式相似。我們進一步檢測了氨芐西林處理后細胞是否激活氧化應激響應程序：通過轉(zhuǎn)錄組分析和實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析多個氧化應激基因的表達，提取暴露于300μg/mL氨芐西林的DOT-T1E細胞總RNA并進行全局表達分析。結果顯示，氨芐西林處理后57個基因表達上調(diào)，22個基因表達下調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)氧化應激相關基因在氨芐西林存在下被調(diào)控；相反，與一般應激相關的基因（如recA和lexA）被誘導表達。為進一步驗證芯片結果，我們通過qRT-PCR定量分析了烷基氫過氧化物酶（T1E_5238）、過氧化氫酶（T1E_3279和T1E_4765）、過氧化氫酶過氧化物酶（T1E_1753）和recA基因的誘導水平：氨芐西林存在下生長的細胞中氧化應激基因未被誘導（相對表達水平為0.88-1.4），而recA的表達上調(diào)了6倍。在對氨芐西林敏感性增強的惡臭假單胞菌DOT-T1E18中，氨芐西林處理也未誘導氧化應激基因表達。這些結果表明，氨芐西林不會導致活性氧（ROS）產(chǎn)生，也不會誘導氧化應激基因表達，但會誘導一般應激響應相關基因。
吲哚是種間信號分子
DOT-T1E的基因組分析未發(fā)現(xiàn)色氨酸酶同源物。為驗證DOT-T1E是否通過其他途徑產(chǎn)生吲哚，我們通過高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）分析了惡臭假單胞菌DOT-T1E在含或不含色氨酸的基礎培養(yǎng)基中生長后的培養(yǎng)上清液，未發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌產(chǎn)生吲哚的跡象；而在大腸桿菌LK111的平行對照實驗中，大腸桿菌在進入穩(wěn)定期早期時產(chǎn)生的吲哚濃度可達400μM。
由于吲哚被描述為種內(nèi)信號分子，我們進一步檢測了大腸桿菌與惡臭假單胞菌突變體共培養(yǎng)是否會影響該土壤細菌的抗生素耐藥性：在含色氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌LK111及其同基因tnaA（色氨酸酶）突變體，將過濾后的培養(yǎng)上清液作為吲哚來源，通過抑菌圈實驗檢測其對DOT-T1E、T1E-18和T1E-PS28抗生素耐藥性的影響（圖2）。
結果顯示，親本菌株（圖2A）和T1E-PS28（圖2A和C）在有無大腸桿菌培養(yǎng)上清液存在時的抗生素耐藥性水平相似；在無培養(yǎng)上清液或添加tnaA突變體上清液時，T1E-18的抑菌圈大于親本菌株，這種差異在替卡西林、氨芐西林和氯霉素作用下尤為顯著（圖2）；而添加大腸桿菌LK111上清液后，T1E-18對所有抗生素的耐受性增強，耐藥性水平與添加純吲哚時相當。這表明腸桿菌產(chǎn)生的吲哚可有效促進惡臭假單胞菌的抗生素耐藥性，通過監(jiān)測惡臭假單胞菌的生長曲線進一步證實：200μg/mL氨芐西林可抑制DOT-T1E18的生長，而添加大腸桿菌上清液可緩解這種抑制效應（盡管細胞進入對數(shù)期前存在短暫延遲，且生長速率比無抗生素時慢20%）（圖3）。
隨后，我們檢測了惡臭假單胞菌野生型、DOT1E-18與產(chǎn)吲哚大腸桿菌菌株在有無抗生素存在時的體內(nèi)生長情況：將大腸桿菌與各惡臭假單胞菌菌株以相同細胞密度（10^5 CFU/mL）接種到不含抗生素或含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，以各菌株單獨接種作為對照；通過在LB+氨芐西林+鏈霉素（大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基）上涂布計數(shù)大腸桿菌細胞數(shù)量，在LB+利福平上計數(shù)DOT-T1E，在LB+利福平+卡那霉素上計數(shù)T1E-18。結果顯示，8小時后共培養(yǎng)物達到穩(wěn)定期；在對照培養(yǎng)物和各共培養(yǎng)物中，大腸桿菌細胞密度均約為10^8 CFU/mL，DOT-T1E或T1E-18的細胞數(shù)量與之相近，表明無抗生素存在時各菌株的適應性相當。我們在300μg/mL氨芐西林存在下重復了上述共培養(yǎng)實驗：大腸桿菌因質(zhì)粒pMRS101攜帶bla基因而對該藥物耐藥，DOT-T1E菌株主要通過TtgABC泵排出抗生素而耐藥，而T1E-18菌株的生長則受氨芐西林抑制（見圖4）；結果顯示，只有當培養(yǎng)基中存在大腸桿菌LK111時，T1E-18才能在氨芐西林存在下生長（圖4），表明種間信號傳導具有功能活性，且惡臭假單胞菌可通過識別大腸桿菌產(chǎn)生的化學信號在含抗生素的培養(yǎng)基中增殖。
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