2結果
2.1病原的分離純化
患病牛肺臟處理液接種PPLO液體培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)至第2代可見培養(yǎng)基由紅變黃并保持澄清。將第3代培養(yǎng)物涂布于PPLO固體培養(yǎng)基，3~5天后可見表面光滑、針尖大小的白色小菌落生長（圖1A）。在40-100X顯微鏡下觀察，菌落呈典型的邊緣整齊的“煎蛋樣”形態(tài)（圖1B）。經(jīng)過3輪液體-固體克隆純化后獲得純培養(yǎng)物，命名為YJ-22。
圖1 YJ-22分離株菌落形態(tài)
(A)固體培養(yǎng)基上的菌落（肉眼觀）；(B)顯微鏡下的菌落形態(tài)（40-100X，“煎蛋樣”）。
2.2 PCR及測序鑒定結果
使用特異性引物MB-P48-F/MB-P48-R擴增純化的YJ-22菌株DNA，在約526 bp處獲得單一的、與陽性對照一致的清晰條帶，陰性對照無條帶（圖2）。測序結果顯示該片段為M.bovis P48基因的部分序列。GenBank BLAST比對分析表明，該序列與參考菌株M.bovis MJ-1(CP042938.1)、M.bovis DADC51(CP040775.1)、M.bovis VK30(CP058467.1)等相應區(qū)域序列的相似性均高于99.3%，確認為牛支原體。
圖2 YJ-22分離株P48基因PCR擴增結果
M：DL2000 DNA分子量標準；1：YJ-22分離株；2：陰性對照（ddH?O）；3：陽性對照（M.bovis標準株DNA）。
2.3生化鑒定結果
YJ-22分離株的生化反應結果見表1。結果顯示，該菌株不能發(fā)酵葡萄糖或甘露醇，不能水解精氨酸或明膠，不分解尿素，但能利用乳糖。這些生化特征完全符合牛支原體的典型特性。
表1 YJ-22分離株生化鑒定結果
2.4生長曲線繪制
根據(jù)間隔取樣測定的CCU LOG值，繪制了YJ-22分離株在PPLO液體培養(yǎng)基中的生長曲線（圖3）。結果顯示，該菌株接種后經(jīng)歷短暫遲緩期（約9小時），隨后進入快速對數(shù)生長期（9-18小時）。在18至45小時間，活菌數(shù)維持在一個較高的平臺期（1×10?~1×10?CCU/mL）。45小時后進入衰亡期，活菌數(shù)逐漸下降，至60小時降至約1×10?CCU/mL。
圖3 YJ-22分離株在PPLO液體培養(yǎng)基中的生長曲線
2.5 YJ-22分離株致病性研究結果
2.5.1臨床癥狀
攻毒組（2頭犢牛）在攻毒后第9天均開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀：咳嗽（尤其驅趕時）、喘氣、呼吸頻率加快、兩側鼻孔有漿液性/粘液性分泌物增多。在攻毒后第3天，兩頭攻毒牛體溫均開始升高（比攻毒前基礎體溫升高約0.7~1.0℃），高體溫狀態(tài)持續(xù)約3天后逐漸恢復至正常水平（圖4）。對照組（2頭犢牛）在整個觀察期內精神、食欲、呼吸均正常，體溫保持平穩(wěn)（圖4），未見咳嗽、流涕等任何異常。攻毒組牛未見明顯的關節(jié)炎癥狀。
圖4攻毒試驗中犢牛的體溫變化曲線
(攻毒組數(shù)據(jù)點為平均值，攻毒時間為第0,1,2天)。
2.5.2排菌情況
對試驗期間采集的所有鼻拭子樣品進行M.bovis分離培養(yǎng)和PCR檢測。攻毒前所有試驗牛的鼻拭子均為陰性。攻毒后，對照組鼻拭子始終陰性。攻毒組兩頭牛在攻毒后第1天（即首次攻毒后）即可檢出病原，在隨后監(jiān)測的22天內多次檢測為陽性（分離鑒定和PCR結果一致），顯示持續(xù)性排菌。具體檢測陽性率（陽性采樣點數(shù)/總采樣點數(shù)）：攻毒1號牛為40%（4/10），攻毒2號牛為50%（5/10）（表2）。
2.5.3剖檢病變
攻毒后第21天剖檢所有試驗牛。對照組兩頭牛的肺臟肉眼觀察均正常，色澤粉紅，質地柔軟有彈性，未見明顯的實變、出血或膿腫，偶見個別點狀出血或輕微粘連（屬于背景病變）。參考Maunsell等標準進行病變評分：對照組1號牛得1分，2號牛得2分，表明肺部無明顯M.bovis相關損傷。
攻毒組兩頭牛的肺臟均呈現(xiàn)嚴重的廣泛性病變（圖5A,B）。肺臟表現(xiàn)為大面積的肉變（肺實變）、肝變（質地如肝）、明顯的充血和出血灶，病變區(qū)域與健康區(qū)域界限清晰。這些病變主要分布在肺的尖葉、心葉和膈葉前緣。攻毒1號牛病變評分9分，攻毒2號牛病變評分11分。其他臟器未見M.bovis相關的特異性病變。
圖5攻毒試驗犢牛肺臟剖檢病變
(A)攻毒1號牛肺：廣泛性肉變、肝變及出血；(B)攻毒2號牛肺：嚴重的肉變、肝變及出血灶；(C)對照1號牛肺：正常；(D)對照2號牛肺：正常（偶見點狀出血）。
2.5.4病理組織學觀察
對照組牛的肺臟組織學結構正常：肺泡大小均勻，間隔清晰，無明顯炎癥細胞浸潤，細支氣管上皮完整（圖6C,D）。
攻毒組牛的肺組織顯示出嚴重的病理改變（圖6A,B）：肺泡結構廣泛破壞，大量肺泡腔實變、塌陷；肺間質增厚，血管擴張充血；可見明顯的局灶性或片狀出血區(qū)域；肺泡腔內、細支氣管腔內及肺間質內可見大量以單核細胞（淋巴細胞、巨噬細胞）為主的炎性細胞浸潤，并伴有不同程度的嗜中性粒細胞浸潤；部分區(qū)域可見纖維結締組織增生（早期纖維化改變）。這些病理變化特征符合牛支原體肺炎的慢性支氣管間質性肺炎表現(xiàn)。
圖6攻毒試驗犢牛肺臟組織病理學變化(H&E染色)
(A)攻毒1號牛：肺結構破壞，實變區(qū)炎癥細胞浸潤（箭頭），間質增寬；(B)攻毒2號牛：肺泡腔融合實變（），間質及肺泡腔大量炎性細胞浸潤（箭頭），出血（#）；(C)對照1號牛：肺泡結構正常；(D)對照2號牛：肺泡結構正常。(標尺：100μm).
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