2結(jié)果
課題組前期在實驗室菌株和工業(yè)衍生菌株表達(dá)纖維素酶及利用木質(zhì)纖維素料發(fā)酵產(chǎn)醇方面做了很多工作,既觀察到了不同菌株在發(fā)酵性能和異源蛋白表達(dá)水平上的巨大差異,也發(fā)現(xiàn)了不同來源β-葡萄糖苷酶表達(dá)所致明顯不同的代謝負(fù)擔(dān)。這里以W303-1A和An-a菌株作為出發(fā)菌株來構(gòu)建UPR響應(yīng)指示菌株,并進一步表達(dá)β-葡萄糖苷酶。選擇26bp UPRE和CYC1基因起始密碼子上游250bp序列組合的雜合啟動子控制下的β-半乳糖苷酶Lac Z編碼基因為報告基因(簡寫為UPRE-lac Z),利用基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因操作技術(shù),構(gòu)建得到W303-1A(leu 2∷UPRE-lac Z)和An-a(leu 2∷UPRE-lac Z);為方便敘述,菌株分別簡稱為WZ和AZ。26bp UPRE實際為KAR2基因的上游激活序列(upstream activating sequence,簡稱UAS);其中的22bp序列5'-GGAAC TGGACAGCGTGTCG AAA-3'是UPRE中的核心序列,為數(shù)百個UPR靶基因共同擁有,在激活UPR的條件下,這些基因由此序列介導(dǎo)而被誘導(dǎo)激活。而250bp序列里不含有UAS,在沒有UAS序列啟動激活的情況下,其導(dǎo)致的基因基礎(chǔ)表達(dá)水平很低,且低于由KAR2相應(yīng)序列所導(dǎo)致的基因基礎(chǔ)表達(dá)水平。這也是本研究選擇此雜合啟動子來調(diào)控Lac Z表達(dá)的原因。
2.1 WZ和AZ構(gòu)建
指示菌株構(gòu)建分如下三大步驟進行。
2.1.1 gRNA表達(dá)載體pRS42H-gLEU2構(gòu)建UPRE-lac Z片段的整合位點選擇在LEU2基因內(nèi),相應(yīng)地,根據(jù)guide RNA設(shè)計原則,靶向LEU2基因位點、供guide RNA合成的DNA序列設(shè)計為5'TATTTACTTTGGTAAGAGAA 3'(參見表2中的引物對P1和P2),其對應(yīng)于LEU2基因ORF的第423~442位堿基序列,亦即GenBank中序列號為NC_001135.5中的第91 324~92 418堿基序列。
首先以Not I酶切線型化的pRS42H-gRNA質(zhì)粒片段為模板,使用引物對P1和P2進行反向PCR,擴增得到6 528bp的PCR片段(見瓊脂糖凝膠電泳圖1a);然后連接、轉(zhuǎn)化和鑒定。即對LB+Amp100篩選平板上生長的菌落進行液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,Not I酶切鑒定和測序。結(jié)果證明轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取物中Not I酶位點被替換為前述20 bp靶向堿基序列,pRS42H-gLEU2質(zhì)粒構(gòu)建成功。
圖1 PCR片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜和供體DNA片段示意圖
2.1.2含UPRE-lacZ基因表達(dá)盒的供體DNA片段制備分別以酵母菌株WC、大腸桿菌菌株DH5α和酵母菌株WC的基因組DNA為模板,使用表2所示三對引物對P3/P4、P5/P6、P7/P8進行三個片段的擴增:含元件H1+UPRE的PCR1片段(364bp),其中H1對應(yīng)LEU2基因ORF內(nèi)第371~442位共72bp序列;含元件lacZ ORF的PCR3片段(3 095bp);含元件TadhI+H2的PCR2片段(302bp),其中H2對應(yīng)LEU2基因ORF內(nèi)第446~515位共70bp序列。再分別以PCR1和PCR3為模板,使用引物對P3、P6進行第一輪重疊交叉延伸PCR反應(yīng),產(chǎn)物命名為PCR13,預(yù)期長度3 439bp;以PCR13和PCR2為模板,使用引物對P3、P8進行第二輪重疊交叉延伸PCR反應(yīng),產(chǎn)物命名為PCR123,預(yù)期長度3 721bp。由圖1b-1d可知五個片段均具有預(yù)期大小;3 721bp PCR產(chǎn)物為供體片段。
2.1.3 W303-1A(leu2∷UPRE-lacZ)和An-a(leu 2∷UPRE-lacZ)構(gòu)建首先將Cas9表達(dá)質(zhì)粒YCplac33-Cas9轉(zhuǎn)化菌株W303-1A和An-a感受態(tài)細(xì)胞,分別得到W303-1A(YCplac33-Cas9)和An-a(YCplac33-Cas9)菌株;制備其感受態(tài)細(xì)胞,將pRS42H-gLEU2質(zhì)粒和3 721bp PCR產(chǎn)物分別共轉(zhuǎn)化,涂布CMG-URA+HyB篩選平板,倒置培養(yǎng);對篩選平板上生長菌落順次進行CMG-URA+HyB平板復(fù)篩、平板顯色、菌落PCR鑒定及測序。平板顯色結(jié)果見圖2,平板顯色菌落PCR鑒定產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖3;結(jié)果證明了轉(zhuǎn)化子顯色反應(yīng)與PCR鑒定結(jié)果之間的高度一致。PCR鑒定用引物對為表2中的P9、P10,陽性菌株和陰性菌株預(yù)期PCR片段分別為4 327bp和795bp。
圖2平板菌落顯色(左W303-1A宿主,右An-a宿主)
圖3 PCR鑒定產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(左W303-1A宿主,右An-a宿主)
分別選擇顯色典型的菌株55#和58#進一步進行測序,測序結(jié)果證明沒有突變。為敘述方便,以下將這兩個指示菌株分別簡稱為WZ和AZ。
2.2 WZ和AZ生長曲線測定
為檢查表達(dá)UPRE-lacZ基因和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)本身可能導(dǎo)致的生長缺陷,首先將指示菌株及其親本菌株一起進行了生長對比評價,結(jié)果見圖4。圖4顯示:WZ和W303-1A之間生長彼此接近;而AZ和An-a相比之下則表現(xiàn)出了輕微的生長抑制,推測可能與lacZ的基礎(chǔ)表達(dá)有關(guān)。
圖4四個菌株的生長曲線
2.3 WZ和AZ對乙酸和乙醇UPR響應(yīng)評價
如前言所述,木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵產(chǎn)醇體系中的乙酸、甲酸、糠醛和乙醇等組分都會抑制酵母細(xì)胞活性、影響發(fā)酵性能。這里先考察指示菌株對乙酸和乙醇的反應(yīng),并附上了衣霉素作為對照。衣霉素是強的UPR誘導(dǎo)劑,通過抑制蛋白質(zhì)的N-糖基化使蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊,引起ER中蛋白質(zhì)的大量積累,從而激活UPR途徑。
先預(yù)實驗考察了衣霉素、乙醇、乙酸三種試劑不同濃度對菌株WZ和AZ生長抑制效應(yīng),據(jù)之設(shè)計了菌株對數(shù)期的添加濃度;添加4h時的結(jié)果見圖5,圖中A代表菌株AZ,W代表菌株WZ。比值為各處理樣品對沒有添加任何試劑的對照樣品即A-1和W-1的OD600值或LacZ酶活值的比值。
圖5不同添加物培養(yǎng)基中限氧培養(yǎng)4 h時的OD600值和β-半乳糖苷酶酶活
很明顯,三種試劑對菌株AZ和WZ的生長都有抑制效應(yīng),以添加乙酸至終濃度0.3%(v/v)的抑制最強,OD600值分別為對照OD600值的62.0%和72.0%。而LacZ酶活值的高低則與生長抑制程度無關(guān):AZ對乙醇的響應(yīng)相對最強,為對照本底值的26.4倍,對衣霉素響應(yīng)則與(乙醇+乙酸)相當(dāng);而WZ對衣霉素的響應(yīng)值為對照本底值的12.6倍。實驗結(jié)果清楚地顯示了兩個菌株在UPR信號響應(yīng)譜上的顯著差異。
2.4 WZ和AZ對β-葡萄糖苷酶表達(dá)的UPR響應(yīng)評價
質(zhì)粒BG(見表1)為高拷貝數(shù)β-葡萄糖苷酶表達(dá)載體,導(dǎo)入酵母菌株后β-葡萄糖苷酶的表達(dá)使得細(xì)胞具有利用纖維二糖生長和發(fā)酵的能力;在以纖維二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基里,在一定范圍內(nèi),菌株的生長情況與細(xì)胞表達(dá)β-葡萄糖苷酶的水平呈正相關(guān)。兩個菌株在YPC液體培養(yǎng)基里生長24h后的酶活值見圖6。菌株WZ(BG)菌液β-葡萄糖苷酶酶活值為菌株AZ(BG)菌液相應(yīng)酶活值的17.5倍,但它們的Lac Z酶活僅為各自對照本底值的5.4倍和3.1倍,暗示了菌株WZ對異源蛋白表達(dá)有較菌株AZ更高的ER加工容量和UPR調(diào)控容量。
圖6菌株WZ和AZ YPC中生長24 h時的酶活
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