摘要
研究沒食子酸對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑菌活性和機理。通過測定沒食子酸對溶藻弧菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)和生長曲線，研究沒食子酸對溶藻弧菌的抑菌活性；測定不同濃度的沒食子酸溶液與溶藻弧菌作用前后，菌液上清液中堿性磷酸酶(AKP)活性、電導(dǎo)率，溶藻弧菌生物被膜、運動性和聚集能力的變化，研究沒食子酸對溶藻弧菌的抗菌機理。結(jié)果顯示，沒食子酸對溶藻弧菌的MIC和MBC分別為4 mg/mL和8 mg/mL。沒食子酸能破壞溶藻弧菌的細(xì)胞壁，增加其細(xì)胞膜通透性，抑制生物被膜的形成，清除成熟的生物被膜，抑制溶藻弧菌的運動和聚集能力。本研究為探明沒食子酸抑制溶藻弧菌的作用機理奠定了良好的基礎(chǔ)，為其防治水生動物溶藻弧菌感染性疾病提供了理論依據(jù)。
正文
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)為弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌屬(Vibrio)的無芽孢、無莢膜的嗜鹽、嗜溫厭氧性革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于海水、入?？诤退a(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，對多種水產(chǎn)動物和人有致病性。近幾年，溶藻弧菌是引起水產(chǎn)動物育苗期和養(yǎng)成期死亡的主要病原之一，溶藻弧菌感染魚類可導(dǎo)致出血、潰瘍或敗血癥，感染蝦類可致蝦苗細(xì)菌性?；Y(bacterial vitrified syndrome,BVS)或?qū)ξr急性肝胰腺壞死病(acute hepatopancreatic necrosis disease)、黑鰓爛鰓或白便綜合征，感染螃蟹(Portunus tritubercularus)可致“牛奶病”或牙膏病，感染海參(Apostichopus japonicus)可致腐皮綜合征(skin ulcerative syndrome,SUS)。此外，溶藻弧菌感染還能引起貝類發(fā)病，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，開發(fā)綠色高效的抗弧菌病藥物已成為當(dāng)前海水養(yǎng)殖動物疾病防治研究的熱點之一。
本課題組曾以分離自患有細(xì)菌性?；Y蝦苗的溶藻弧菌和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)為研究對象，開展了50味中藥的抗菌活性研究，結(jié)果顯示，訶子(Chebulae fructus)、五倍子(Galla chinensis)、第3期王春元等:沒食子酸對溶藻弧菌的抑菌活性及機理研究213石榴皮(Granati pericarpium)、地榆(Sanguisorbae radix)等中藥的抑菌效果相對較好，以訶子為主藥的處方[訶子30 g、五味子(Schisandra chinensis)20 g、香附(Cyperi rhizome)20 g]對溶藻弧菌人工感染蝦苗致細(xì)菌性?；Y的治療效果也較好。鞣質(zhì)是訶子、五倍子、石榴皮和地榆(劉海英,2009)等中藥中非常重要的多酚類活性成分，它是由沒食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其他多元醇)酯、黃烷醇及其衍生物的聚合物以及二者混合共同組成。已有報道證明，沒食子酸(gallic acid,GA)具有較好的抗菌、抗炎、抗氧化、保護肝臟和提高免疫功能等多種藥理作用，其可能成為一種潛在的防病保健獸藥或飼料添加劑使用。
中藥可通過抑制細(xì)菌生物膜的形成和發(fā)育、破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、影響菌體蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)核酸的合成、促進氧化應(yīng)激的產(chǎn)生以及抑制毒力因子的表達等方面的作用來抑制或殺滅細(xì)菌。雖然沒食子酸已被報道對多種細(xì)菌有良好的抗菌作用，但尚未報道其對溶藻弧菌的抗菌活性和可能的作用方式。本研究探討沒食子酸對溶藻弧菌的抗菌活性及其作用機制，為篩選和研發(fā)防治水產(chǎn)動物弧菌感染性疾病的藥物提供數(shù)據(jù)支持。
1、材料與方法
1.1實驗菌液的制備
溶藻弧菌：菌株實驗室編號為P4A，分離自患BVS對蝦養(yǎng)殖場的凡納對蝦(Penaeus vannamei)蝦苗，保存于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖病原庫。將凍存的溶藻弧菌復(fù)蘇后，以TSB固體培養(yǎng)基活化純培養(yǎng)，挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基，于28℃、180 r/min恒溫振蕩過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
1.2藥液的制備
沒食子酸：純度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品。以PBS將沒食子酸配制成16 mg/mL的藥液，過濾除菌，并用PBS倍比稀釋制成不同濃度的沒食子酸溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?
1.3最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定
采用二倍稀釋法測定。取對數(shù)生長期的溶藻弧菌，用TSB培養(yǎng)基稀釋至1×10?CFU/mL。分別取100μL不同濃度的沒食子酸溶液加入96孔板，并加入等量的1×10?CFU/mL菌液，再以菌液加等量PBS為陽性對照組，TSB培養(yǎng)基加等量PBS為空白對照組。實驗組和對照組分別加入氯化三苯四氮唑(TTC)10μL，以檢驗細(xì)菌是否生長。每組設(shè)3個平行。將96孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)陽性對照組變紅時，記錄沒食子酸的抑菌效果，實驗組變色孔的上一個孔所對應(yīng)的濃度即為MIC。從未變紅的實驗組各孔取樣100μL，分別涂布于TSB瓊脂平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。瓊脂平板上細(xì)菌菌落數(shù)少于5且藥液濃度最低的，即為MBC。
1.4生長曲線測定
測定不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌生長的影響。按1.3中的方法配制菌液。取1×10?CFU/mL溶藻弧菌菌液100μL，分別加入不同濃度的沒食子酸溶液，使藥物終濃度分別為2MIC、1MIC、1/2MIC和1/4MIC。以菌液加等量PBS為陽性對照組，TSB加等量PBS為空白對照組，每組設(shè)3個平行。在全自動微生物生長曲線測定儀中28℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h在600 nm波長下測定各組吸光值。
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