1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 原輔料與菌種：河北省石家莊優(yōu)質(zhì)鴨梨、秦美獼猴桃、紅富士蘋果、白砂糖，購自四川宜賓超市；Lalvin71B酵母，法國(guó)LALLEMAND公司。
1.1.2 培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%（其中固體培養(yǎng)基需要額外添加2%的瓊脂）；121 ℃，0.15 MPa，滅菌20 min。
1.1.3 主要試劑：蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（均為生化試劑），成都市科隆化學(xué)品有限公司；偏重亞硫酸鉀、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水葡萄糖、無水乙醇、酒石酸鉀鈉（均為分析純），北京奧博生物技術(shù)有限公司；2 í Taq Master Mix（生化試劑），大連寶生物；Lallzyme EX果膠酶（生化試劑），法國(guó)拉曼公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（生化試劑），北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
MicroScreen-HT實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀，杰靈儀器制造（天津）有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DM3000生物顯微鏡，德國(guó)徠卡；MaxQ4000恒溫冷凍搖床，美國(guó)Themo科技公司；ProtoCOL3菌落計(jì)數(shù)分析儀，北京生科宇晟科技有限公司；M367983 PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；CI54DS立式壓力蒸汽滅鍋，廈門儀器有限公司；WYT-Ⅱ A手持糖度儀，成都格納絲商貿(mào)公司；HR1833榨汁機(jī)，中國(guó)飛利浦公司。
1.3 方法
1.3.1 產(chǎn)香酵母的分離純化：選取新鮮鴨梨、獼猴桃、蘋果的果皮和枝梗以及中高溫大曲各10 g，用無菌水重懸1 h后吸取1 mL接種于加有青霉素的YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min條件下富集培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)液1 mL稀釋至10-3、10-4、10-5，分別取100 mL均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。當(dāng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，將一滴美藍(lán)染色劑與微量菌落混合在載玻片上，并用蓋玻片覆蓋，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。挑取具有典型酵母特征的單菌落連續(xù)劃線傳代培養(yǎng)2–3次后得到純化菌株，與60%無菌甘油1:1混合，于-80 ℃冷藏保存。
1.3.2 產(chǎn)香酵母的初篩：將凍存的菌株活化后在YPD固體培養(yǎng)基上劃線接種，在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。參考劉文麗等人的嗅聞法，將斜面置于鼻孔下方嗅聞，評(píng)價(jià)指標(biāo)為香氣的有無、濃淡等產(chǎn)香效果，初步篩選出香氣較濃或香氣特殊的菌株。
1.3.3 產(chǎn)香酵母的復(fù)篩：將初篩出的菌株活化，以3%接種量接種于含100 mL產(chǎn)酯發(fā)酵液（8%葡萄糖、1%酵母浸粉、2%蛋白胨）的錐形瓶中，28 ℃條件下靜置發(fā)酵7 d，取150 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入250 mL圓底燒瓶中，采用回流皂化法測(cè)定培養(yǎng)液的總酯含量（以乙酸乙酯計(jì)），篩選出產(chǎn)酯量較高的菌株。
1.3.4 產(chǎn)香酵母的分子生物學(xué)鑒定：產(chǎn)香酵母的DNA提取，參考趙宏宇等人的方法。產(chǎn)香酵母的菌株序列擴(kuò)增：以序列NS1（5′-GTAGTCATATGCTTG?TCTC-3′）為正向引物和NS4（5′-CTTCCGTCAATT?CCTTTAAG-3′）為反向引物，擴(kuò)增酵母菌18S rRNA序列。PCR反應(yīng)體系，參考李瑞平等人的方法：Master Mix 25 mL，正、反向引物（10 mmol/L）各1 mL，ddH2O補(bǔ)充至21 mL，DNA模板2 mL。PCR反應(yīng)條件，參考農(nóng)穎杰等人的方法：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR程序執(zhí)行結(jié)束后取出產(chǎn)物，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)：上樣，吸取3–5 mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，以分子量大小為2 000的DNA Marker（2 mL）為標(biāo)準(zhǔn)，電泳電壓為120 V。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照試劑盒操作步驟回收條帶，產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站用BLAST將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，挑選合適的序列，比對(duì)并生成系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.5 產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)曲線及耐受性分析：產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)曲線測(cè)定：參考劉小雨等人的方法，取30 mL活化后的產(chǎn)香酵母菌液，加入含有970 mL YPD液體培養(yǎng)基的48孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每塊孔板設(shè)置3個(gè)空白試驗(yàn)以檢驗(yàn)該孔板是否染菌。將孔板放置于實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀中，冷水槽溫度設(shè)置為0 ℃，樣品槽內(nèi)腔溫度設(shè)置為28 ℃。以30 min的時(shí)間間隔測(cè)量OD600值，持續(xù)48 h。記錄數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制不同產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)曲線圖。
產(chǎn)香酵母耐受性分析：參考劉曉柱等人的方法，以YPD液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗(yàn)，考察不同二氧化硫含量（100、200、300、400、500 mg/L）、不同酒精度（7% vol，9% vol，1% vol，13% vol，15% vol）、不同初始糖度（100、150、200、250、300 g/L）、不同培養(yǎng)溫度（22、25、28、31、34 ℃）條件下產(chǎn)香酵母的OD600值，篩選出耐受能力較強(qiáng)的酵母菌株。
1.3.6 產(chǎn)香酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵果酒的制備工藝：參考張琛等的果酒釀造工藝流程：水果分選→清洗→去皮→打漿→抑菌（添加偏重亞硫酸鉀）→酶解（加入0.02 g/L的果膠酶室溫酶解2 h）→調(diào)糖（22° BX）→接種產(chǎn)香酵母（3%產(chǎn)香酵母種子液）→發(fā)酵（28 ℃靜置發(fā)酵24 h）→接種釀酒酵母（3%釀酒酵母種子液）→發(fā)酵（28 ℃靜置發(fā)酵7 d）→固液分離→澄清→過濾→成品。
產(chǎn)香酵母活化：將凍存酵母菌種用YPD液體培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，按3%接種量接種與新的YPD液體培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下靜置培養(yǎng)24 h，離心，用無菌生理鹽水調(diào)整菌體數(shù)達(dá)到1 × 108 CFU/mL，備用。
釀酒酵母干粉活化：取適量干酵母，加入10倍體積的糖溶液，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)30 min，再接種至10倍體積的果汁中，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)極培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水調(diào)整菌體數(shù)達(dá)到1 × 108 CFU/mL，備用。
1.3.7 產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵果酒的感官評(píng)價(jià)：在專業(yè)品評(píng)室內(nèi)由12名品評(píng)小組成員（男女各6名，年齡20–40歲）采用定量描述感官分析法，對(duì)混菌發(fā)酵和單菌發(fā)酵的梨酒、獼猴桃酒、蘋果酒進(jìn)行觀察、嗅聞、品嘗，在外觀、香氣、口感方面進(jìn)行感官品評(píng)，產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵果酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)進(jìn)行，具體見表1。
1.3.8 產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵果酒的理化指標(biāo)檢測(cè)：酒精度、總糖含量、總酸含量的檢測(cè)參照GB/T 15038-2006和《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
表1 產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
1.4 數(shù)據(jù)處理
結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示，每個(gè)試驗(yàn)平行3次。應(yīng)用WPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用IBM SPSS Statistics 27軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），應(yīng)用Origin 2021和Excel軟件繪圖。
相關(guān)新聞推薦
1、冷凍休克處理含有減毒沙門氏菌的巨噬細(xì)胞，激活抗腫瘤免疫反應(yīng)
2、新型廣譜陰溝腸桿菌噬菌體ZX14的分離鑒定、生長(zhǎng)曲線、體體外殺菌活性實(shí)驗(yàn)（五）
3、飲用水中磷對(duì)微生物生長(zhǎng)的限制作用
4、測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線最常用的方法，細(xì)胞計(jì)數(shù)法怎么鋪板如何換算
5、水體擾動(dòng)對(duì)藻生長(zhǎng)機(jī)制與QCS水庫富營(yíng)養(yǎng)化控制的影響研究