對(duì)F44、DeltardrA和FrdrA菌株進(jìn)行酸耐受性試驗(yàn)。由圖2D可知,在pH為3.0的酸應(yīng)激下,F44菌株的存活率為22.37%±3.09%,DeltardrA菌株的存活率為47.89%±5.18%,FrdrA菌株的存活率為26.22%±2.60%。與F44菌株相比,FrdrA菌株的酸耐受能力無(wú)顯著變化;而DeltardrA菌株的酸耐受能力是F44菌株的2.14倍,二者差異極顯著(P<0.01),說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子RdrA對(duì)F44菌株酸耐受能力起抑制作用。
測(cè)定F44和DeltardrA菌株在發(fā)酵6、8、10、12h時(shí)的Nisin效價(jià)，結(jié)果如圖2E所示?？梢钥闯觯現(xiàn)44和DeltardrA菌株的Nisin產(chǎn)量均在8h達(dá)到峰值,F44菌株的Nisin效價(jià)為(1990.08±45.46)IU/mL,DeltardrA菌株的Nisin效價(jià)為(2073.66±65.57)IU/mL。DeltardrA菌株與對(duì)照菌株相比，Nisin產(chǎn)量略有提升，但二者差異不顯著。
綜上結(jié)果分析，轉(zhuǎn)錄因子RdrA對(duì)菌株生長(zhǎng)情況和Nisin產(chǎn)量影響不顯著，但對(duì)F44菌株的酸耐受及Nisin耐受能力有抑制作用。
2.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子RdrA對(duì)于菌株中基因轉(zhuǎn)錄的影響，以DeltardrA菌株為試驗(yàn)組，F(xiàn)44為對(duì)照組,利用IlluminaNovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)樣本進(jìn)行相關(guān)性分析，以保證試驗(yàn)樣本合理、數(shù)據(jù)可靠。試驗(yàn)采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示樣品間基因的表達(dá)水平相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.8~1.0之間屬于極強(qiáng)相關(guān)，越接近于1表明樣品之間表達(dá)模式越接近。如圖3所示，兩組平行樣本間的相關(guān)性高，樣本可以進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選，將log2foldchange
1且P值<0.05的基因定義為差異表達(dá)基因(DEGs)。
由表4可見(jiàn),DEGs共12個(gè),其中6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)，6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄量顯著下調(diào)。通過(guò)eggNOG的功能分類分析(圖4),發(fā)現(xiàn)差異顯著基因集中在“P.無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”“F.核酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”“G.碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”“T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”“E.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”“J.翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與合成”及“L.基因重組、復(fù)制與修復(fù)”幾大類中。其中，J、L類基因影響蛋白質(zhì)修飾和DNA分子的保護(hù)與修復(fù)，對(duì)細(xì)菌抵御酸脅迫至關(guān)重要。KEGG富集分析表明(圖5),DEGs集中在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘧啶代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝以及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相關(guān)代謝途徑中，其中氨基酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝與eggNOG功能分類分析結(jié)果一致，但沒(méi)有與菌株酸耐受直接相關(guān)的代謝通路。
表4菌株△rdrA中轉(zhuǎn)錄水平變化顯著基因
圖4菌株△rdrA中轉(zhuǎn)錄差異顯著基因的eggNOG功能分類結(jié)果
注：J.翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與合成；A.RNA加工修飾；K.轉(zhuǎn)錄；L.基因重組、復(fù)制和修復(fù)；B.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；D.細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分裂；Y.核結(jié)構(gòu)；V.抵御機(jī)制；T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；M.細(xì)胞壁/膜/被膜的生物合成；N.細(xì)胞活性；Z.細(xì)胞骨架；W.胞外結(jié)構(gòu)；U.胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；O.翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白；C.能量生成和轉(zhuǎn)換；G.碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；E.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F.核酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；H.輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)代謝；I.脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；P.無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q.次級(jí)代謝物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；R.主要功能預(yù)測(cè)；S.未知功能。
圖5菌株△rdrA差異表達(dá)基因KEGGPathway富集分析
2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，對(duì)顯著差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。其中，D-蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白編碼基因plpA、plpB、plpC的相對(duì)表達(dá)量分別為1.20±0.14、1.46±0.22、1.39±0.20；O-乙酰高絲氨酸巰基酶編碼基因cysD表達(dá)量為1.38±0.35；重組DNA修復(fù)蛋白編碼基因DYH_g1322表達(dá)量為1.63±0.25；蛋白N端乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因yhjG表達(dá)量為1.54±0.17。結(jié)合圖5可以看出，上述基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以作為研究轉(zhuǎn)錄因子RdrA調(diào)控機(jī)制的依據(jù)。
圖6實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果
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