研究簡(jiǎn)介
冷凍電鏡的進(jìn)步刺激了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的革命。然而對(duì)于接近大約40 kDa的冷凍電鏡尺寸閾值的膜蛋白，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體，缺乏可區(qū)分的結(jié)構(gòu)特征使得圖像對(duì)齊和結(jié)構(gòu)測(cè)定成為一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。此外分辨樣品中的多個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)象是冷凍電鏡的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)，但代表著更大程度的難度。本研究介紹了一種利用冷凍電鏡（cryo-EM）解析小分子MFS（Major Facilitator Superfamily）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的新策略。MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是最大的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，參與多種物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，但其結(jié)構(gòu)解析面臨挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于接近冷凍電鏡大小閾值（約40 kDa）的膜蛋白。研究人員通過(guò)在MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端引入一個(gè)剛性的基準(zhǔn)標(biāo)記（fiducial marker，BRIL域），并利用AlphaFold2預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，成功解析了金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NorA的四種結(jié)構(gòu)，包括向內(nèi)開放、向內(nèi)封閉和封閉構(gòu)象，其中三種構(gòu)象來(lái)自單一樣本。該策略通過(guò)將目標(biāo)蛋白的最后一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域螺旋與BRIL的第一個(gè)螺旋通過(guò)短的聚丙氨酸連接，增強(qiáng)了螺旋性，從而提高了圖像對(duì)齊和結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種融合蛋白在與特異性抗體（BAG2）結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，并且在冷凍電鏡下能夠解析出清晰的結(jié)構(gòu)。此外，研究人員還驗(yàn)證了該方法對(duì)其他MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如GlpT、Bmr和Blt）的適用性，表明這種策略可能對(duì)大多數(shù)MFS家族成員都有效。該研究不僅為解析小分子膜蛋白的結(jié)構(gòu)提供了一種新的、高效的方法，而且對(duì)于理解MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能和機(jī)制，以及開發(fā)針對(duì)這些蛋白的藥物具有重要的推動(dòng)作用。
Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
使用E.coli C43(DE3)菌株，分別轉(zhuǎn)化含有野生型NorA、NorA-BRIL3A和一個(gè)失活突變體NorA(E222Q/D307N)的質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到含有100μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，加入20μM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1:200的比例稀釋到新鮮的LB培養(yǎng)基中，加入20μM IPTG和100μg/mL卡那霉素。同時(shí)，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的諾氟沙星（nor?oxacin），濃度范圍從0μg/mL到1.6μg/mL，以評(píng)估不同濃度下細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。使用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀設(shè)備在30°C下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔15分鐘自動(dòng)測(cè)量一次OD600nm（光密度值），以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
開發(fā)了一種基于冷凍電鏡（cryo-EM）的基準(zhǔn)輔助策略，用于解析小分子MFS（Major Facilitator Superfamily）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)。通過(guò)在MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端引入一個(gè)剛性的BRIL（Bacteriorhodopsin-like）域作為基準(zhǔn)標(biāo)記，并利用AlphaFold2預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究人員成功解析了金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NorA的四種結(jié)構(gòu)，包括向內(nèi)開放、向內(nèi)封閉和封閉構(gòu)象。驗(yàn)證了該方法對(duì)其他MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如GlpT、Bmr和Blt）的適用性，表明這種策略可能對(duì)大多數(shù)MFS家族成員都有效。通過(guò)分析1,118種MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)，研究人員估計(jì)約50-75%的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以通過(guò)C末端融合BRIL域來(lái)解析其結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)的解析驗(yàn)證了設(shè)計(jì)策略的有效性，并展示了該方法在解析多種構(gòu)象中的優(yōu)勢(shì)。
圖1、NorA-BRIL結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)。a）共享螺旋方法的示意圖，其中NorA的C端螺旋（灰色）與BRIL的N端螺旋（藍(lán)色）相鄰，如虛線框所示。b）選擇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列中要保留的最后一個(gè)天然殘基的三個(gè)推薦標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于NorA，選擇Arg380是因?yàn)樗荰M12螺旋中滿足三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的最后一個(gè)殘基。c）融合蛋白序列和NorA-BRIL-BAG2結(jié)構(gòu)模型的預(yù)測(cè)。左：復(fù)合物的NorA-BRIL部分（灰色的NorA;藍(lán)色的BRIL）是使用AlphaFold2預(yù)測(cè)的，而BAG2（淡黃色）是通過(guò)將BRIL-BAG2（PDB ID：6CBV）34的晶體結(jié)構(gòu)中的BRIL與NorA-BRIL AlphaFold2預(yù)測(cè)中的BRIL進(jìn)行比對(duì)來(lái)建模的。
圖2、NorA-BRIL1A和NorA-BRIL3A與BAG2復(fù)合物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡。a、b在pH值為7.5的PMAL-C8中，在不存在（黑色跡線）或存在3倍過(guò)量的BAG2（灰色跡線）的情況下，NorA-BRIL1A（a）和NorA-BRIL3A（b）的SEC色譜圖。箭頭表示對(duì)應(yīng)于單獨(dú)NorA-BRIL或NorA-BRIL-BAG2復(fù)合物的SEC峰。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，注射相同量的NorA-BRIL。對(duì)于NorA-BRIL1A，添加BAG2后，峰積分增加了1.41倍。對(duì)于NorA-BRIL3A，添加BAG2后，峰積分增加了3倍。c、d NorA-BRIL1A-BAG2（c）和NorA-BRIL3A-BAG2復(fù)合物（d）的示例性2D類別。（e）和NorA-BRIL 3A-BAG2復(fù)合物（f）的冷凍電鏡圖疊加，顯示在部分透明的灰色表面，相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型顯示在卡通中。
圖3、NorA-BRILand NorA-的制備和表征。a、b)pH 7.5下PMAL-C8中NorA-BRIL。a,b.pH 7.5時(shí)PMAL-C8中NorA-BRIL1A(a)(b)NorA-BRIL3A的SEC色譜圖。每次實(shí)驗(yàn)均注射等量的NorA-BRIL。c,d.與NorA-BRIL1A(c)和NorA-BRIL3A對(duì)應(yīng)的2D類復(fù)合物的示例性。(d)面板c和面板d的顆?？倲?shù)分別為7,449和8,714。e,f）NorA-bril3a、NorA和對(duì)照的生長(zhǎng)抑制曲線。測(cè)定在大腸桿菌C43（DE3）細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NorA突變體。記錄OD600nm值作為時(shí)間的函數(shù)，不同顏色指示的諾氟沙星濃度(f)。抑制得到每個(gè)樣品在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(e)50%的濃度值（IC50）。類似生長(zhǎng)抑制結(jié)果，即NorA-BRIL3A賦予強(qiáng)表型，被復(fù)制在總共四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中。g.在pH 5.0條件下重組為PMAL C8雙酚的NorA-BRIL3A的SEC色譜圖不存在（黑色）和存在BAG2（粉紅色），后者用于制備NorA-BRIL3A-BAG2配合物用于低溫電鏡。h.NorA-BRIL3A-BAG2復(fù)合物對(duì)應(yīng)峰段的SDS-PAGE凝膠。
圖4、NorA-BRIL 3A-BAG2-Fab36樣品的冷凍電鏡結(jié)果。a）pH值為7.5的NorA-BRIL 3A-BAG2-Fab36樣品的示例性冷凍電鏡2D類別。右側(cè)的展開視圖顯示了其中一個(gè)2D類，表示復(fù)合物中對(duì)應(yīng)于NorA、BRIL、BAG2和Fab36的區(qū)域。b）NorA-BRIL 3A-BAG2-Fab36樣品的冷凍電鏡圖的兩個(gè)視圖顯示在10σ處，其中σ是圖的標(biāo)準(zhǔn)差。平行的灰色線表示含有NorA的脂質(zhì)雙層的表示。c）NorA-BRIL 3A-BAG2-Fab36樣品的冷凍電鏡圖顯示在3σ處?？騾^(qū)域?qū)?yīng)于BRIL和BAG2域。d）NorA TM12部分的模型到映射疊加（左）和局部分辨率冷凍電鏡映射（右）以及NorA-BRIL 3A-BAG2-Fab36樣品中連接NorA和BRIL的丙氨酸接頭。
圖5、使用BRIL融合方法提高了NorA向外開放的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率。a）NorA-BRIL 3A-BAG2-Fab36樣品的結(jié)構(gòu)（左）和冷凍電鏡圖（右），顯示NorA（灰色）和Fab36（輕鏈為淺橙色，輕鏈為藍(lán)色）。冷凍電鏡圖的總體分辨率為2.56?。冷凍電鏡圖以10σ顯示，其中σ是圖的標(biāo)準(zhǔn)差。b）已發(fā)表的NorA-Fab36復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（右）和冷凍電鏡圖（左），顯示NorA（灰色）和Fab36（輕鏈為淺橙色，輕鏈為藍(lán)色）18。冷凍電鏡圖的總體分辨率為3.16?。冷凍電鏡圖以10σ顯示。c）NorA-BRIL 3A-Fab36（淡黃色）和NorA-Fab36（PDB ID：7LO8，灰色）結(jié)構(gòu)的NorA（左）和CDRH3（右）的疊加。NorA和CDRH3的主干r.m.s.d.值分別為0.626?和0.554?。d）模型到圖擬合（左）和局部分辨率冷凍電鏡圖（右）顯示了插入NorA底物結(jié)合口袋的CDRH3環(huán)周圍的選定區(qū)域。
總結(jié)
冷凍電鏡的進(jìn)步刺激了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的革命。然而對(duì)于接近大約40 kDa的冷凍電鏡尺寸閾值的膜蛋白，包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體，缺乏可區(qū)分的結(jié)構(gòu)特征使得圖像對(duì)齊和結(jié)構(gòu)測(cè)定成為一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。此外，分辨樣品中的多個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)象是冷凍電鏡的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)，但代表著更大程度的難度。在這里研究人員描述了一種在AlphaFold2中來(lái)自主要促進(jìn)子超家族（MFS）的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端引入剛性基準(zhǔn)標(biāo)記（BRIL結(jié)構(gòu)域）的策略。這種方法涉及通過(guò)短的聚丙氨酸接頭將靶蛋白的最后一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域螺旋與BRIL的第一個(gè)螺旋融合，以促進(jìn)螺旋性。將這種策略與BRIL特異性Fab相結(jié)合，研究人員闡明了42 kDa金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NorA的四種冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，其中三種來(lái)自對(duì)應(yīng)于向內(nèi)開放、向內(nèi)閉塞和閉塞構(gòu)象的單個(gè)樣品。因此，這種融合構(gòu)建體促進(jìn)了表征NorA構(gòu)象景觀的實(shí)驗(yàn)，并驗(yàn)證了設(shè)計(jì)，以避免與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生空間沖突，從而將BRIL/抗體對(duì)定位在方向上。后者是通過(guò)AlphaFold2預(yù)測(cè)實(shí)現(xiàn)的，這最大限度地減少了猜測(cè)并減少了篩選多個(gè)構(gòu)建體的需要。
研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法對(duì)另外三種MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GlpT、Bmr和Blt）的適用性，結(jié)果支持轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和BRIL之間的剛性連接蛋白。成功應(yīng)用于四種MFS蛋白，這是自然界中最大的次生轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，以及對(duì)該家族的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的分析表明，該策略將成為使用冷凍電鏡研究其他MFS成員的寶貴工具。BioScreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀能夠自動(dòng)化地監(jiān)測(cè)細(xì)胞在不同條件下的生長(zhǎng)情況，每隔15分鐘自動(dòng)記錄一次OD600nm值。這種高頻率的監(jiān)測(cè)使得研究人員能夠精確地觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化，從而更準(zhǔn)確地評(píng)估不同濃度諾氟沙星對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。通過(guò)比較不同濃度諾氟沙星下的生長(zhǎng)抑制情況，研究人員能夠明確融合蛋白是否保留了野生型NorA的抗生素外排功能，這對(duì)于驗(yàn)證融合蛋白的生物學(xué)功能具有重要意義。本研究為解析小分子膜蛋白的結(jié)構(gòu)提供了一種新的、高效的方法，特別是在解析多種構(gòu)象和與底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)方面具有重要意義。這種策略不僅提高了結(jié)構(gòu)解析的分辨率，還減少了實(shí)驗(yàn)篩選的工作量，為未來(lái)的研究提供了寶貴的工具。此外該方法的成功應(yīng)用為理解MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能和機(jī)制，以及開發(fā)針對(duì)這些蛋白的藥物提供了重要的推動(dòng)作用。
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