霉菌毒素是由真菌產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)。土壤、植物和青貯飼料中均可發(fā)現(xiàn)霉菌毒素。霉菌毒素既可在農(nóng)作物大田收獲時形成，在不適宜的貯存條件下，也可繼續(xù)在收獲后的農(nóng)作物上形成。較高的濕度通常有利于飼料中霉菌的生長和霉菌毒素的產(chǎn)生。飼料中檢出率比較高和對動物影響比較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素。
黃曲霉毒素主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。一般來說，溫度30℃、相對濕度80%、谷物水分在14%以上（花生的水分在9%以上）最適合黃曲霉菌繁殖和生長。在24～34℃，黃曲霉菌產(chǎn)毒量最高。
嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀桿菌產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物（單端孢霉烯族化合物中的一種）構(gòu)成，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品。人和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。
玉米赤霉烯酮又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一種雌激素真菌毒素。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麥類、谷物等，在世界各地各種糧谷與飼料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發(fā)生雌激素亢進癥，導(dǎo)致動物不孕或流產(chǎn)，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。
霉菌毒素的生物降解是近年來國內(nèi)外霉菌毒素脫毒技術(shù)方面的一個研究熱點。徐劍宏等用脫氧雪腐鐮刀菌烯醇多次傳代富集培養(yǎng)從小麥的土壤中分離到一株霉菌毒素降解菌，該菌對不同單端孢霉烯族毒素的降解率達(dá)到90%以上。牛天貴等用香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基，以動物糞便、發(fā)霉糧食、腐敗飼料、枯枝敗葉和發(fā)酵食品為實驗材料，先進行初篩，獲得能降解香豆素的菌株，再分別以黃曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A為唯一碳源的培養(yǎng)基進行第2次篩選，結(jié)果獲得一株對黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A均能降解的地衣芽孢桿菌。進一步試驗表明，此地衣芽孢桿菌對玉米面中低濃度和高濃度的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A均能有效降解，降解率分別達(dá)到82.9%、78.3%和75.0%、73.5%。陳志敏等分別將黃曲霉毒素降解菌、玉米赤霉烯酮降解菌和嘔吐毒素降解菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后通過固液分離、超濾濃縮獲得3種細(xì)菌的霉菌毒素降解酶液，復(fù)合配制成霉菌毒素降解酶制劑，對飼料霉菌毒素的去除率達(dá)到80%以上。這些研究表明應(yīng)用酶解技術(shù)降解飼料中的霉菌毒素具有很好的應(yīng)用前景。
產(chǎn)酶益生素可以提高畜禽對日糧的消化利用率，減少糞便排放量，提高畜禽的生產(chǎn)性能。芽孢桿菌以芽孢形式存在時，對環(huán)境的抵抗力強，在適宜條件下又可復(fù)活，恢復(fù)生物學(xué)功能。因此，芽孢桿菌是生產(chǎn)益生素的良好菌種。本研究旨在篩選對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮均有較好降解作用的芽孢桿菌，以便為開發(fā)具有霉菌毒素降解作用的新型產(chǎn)酶益生素奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1豬糞
安徽九鼎農(nóng)業(yè)科技發(fā)展股份有限公司原種場中的健康成年母豬正常糞便。
1.1.2培養(yǎng)基
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、瓊脂1.5 g、蒸餾水100 mL，pH7.2～7.4。
富集培養(yǎng)基(牛天貴，2009)：(NH4)2HPO40.1 g、KH2PO40.1 g、Na2HPO40.2 g、Na2SO40.05 g、NaNO30.1 g、3種霉菌毒素(黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮)適量(第1、2和3次富集濃度分別為1、5、10 mg/L)、蒸餾水100 mL，pH7.2～7.4。
霉菌毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基(牛天貴，2009)：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、霉菌毒素0.5 mg、蒸餾水100 mL、pH 7.2～7.4。
1.1.3主要試劑
玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自天津一方科技有限公司。玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和黃曲霉毒素的ELISA檢測試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。
1.1.4主要儀器
手提式高壓滅菌鍋（上海銳風(fēng)儀器制造有限公司）、SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、PRO全自動微生物生長曲線分析儀（BIOSCREEN C 公司）、318MC型酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司）。
1.2方法
1.2.1霉菌毒素降解菌的富集培養(yǎng)
稱取0.5 g母豬糞便放入滅菌試管中，加入5 mL滅菌生理鹽水，用滅菌吸管充分吸吹混勻。用無菌紗布封好試管口后，放入80℃水浴中加熱15 min殺死非芽孢菌，取出冷卻后，用無菌生理鹽水按100倍、1 000倍、10 000倍梯度稀釋樣品。分別取各稀釋度的樣品溶液100μL涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)7 d，直到菌落充分長出。
將各平板上長出的菌落用滅菌生理鹽水洗下，混合后作為原始菌液，約8 mL。將原始菌液放入80℃水浴中加熱15 min以充分殺死非芽孢菌，冷卻后吸取100μL涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h。將長出的菌落用5 mL滅菌生理鹽水洗下，吸取100μL菌液接種到5 mL第1次富集培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1周。取100μL第1次富集培養(yǎng)菌液，傳代接種于5 mL第2次富集培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1周，再取100μL所得培養(yǎng)物，傳代接種于5 mL第3次富集培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1周。這樣共傳代富集3次。
1.2.2霉菌毒素降解菌的定向篩選
1.2.2.1能降解嘔吐毒素的芽孢桿菌定向篩選
將最終富集培養(yǎng)獲得的菌液10 000 r/min離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入無菌生理鹽水5 mL，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，同法清洗3次以除去富集培養(yǎng)菌液中殘留的富集培養(yǎng)基液。最后一次離心獲得的細(xì)菌沉淀，用5 mL滅菌生理鹽水懸浮。取100μL菌液接種于5 mL嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。挑取營養(yǎng)瓊脂平板上長出的單菌落分別接種于5 mL嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h。分別將各單菌落的培養(yǎng)液在10 000 r/min離心15 min，吸取各自上清2 mL，用嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒測定嘔吐毒素含量（T1），測定方法參照試劑盒說明書。以嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基的嘔吐毒素含量（T0）為參照，計算各單菌落對嘔吐毒素的降解率：x(%)=（T0-T1）/T0×100%。
1.2.2.2能降解玉米赤霉烯酮的芽孢桿菌定向篩選
將對嘔吐毒素降解率達(dá)70%以上的嘔吐毒素降解菌分別轉(zhuǎn)接到玉米赤霉烯酮定向篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h。參照嘔吐毒素降解率的測定方法，用玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒檢測玉米赤霉烯酮含量，并計算培養(yǎng)后玉米赤霉烯酮的降解率。
1.2.2.3能降解黃曲霉毒素B1的芽孢桿菌定向篩選
將對玉米赤霉烯酮降解率達(dá)70%以上的玉米赤霉烯酮降解菌分別轉(zhuǎn)接到黃曲霉毒素B1定向篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h。參照嘔吐毒素降解率的測定方法，用黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中黃曲霉毒素B1含量，并計算培養(yǎng)后黃曲霉毒素B1的降解率。
1.2.3目標(biāo)細(xì)菌的形態(tài)觀察
選取對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1綜合降解率最理想的菌種作為目標(biāo)菌種。將目標(biāo)菌種劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。觀察記錄菌落形態(tài)。挑取單菌落，制成涂片，分別進行革蘭氏染色和美蘭染色，觀察其菌落形態(tài)。
相關(guān)新聞推薦
1、一株具有較強木質(zhì)素降解能力的細(xì)菌XKG6生長最適宜PH與溫度
2、加勒比海紅樹林中發(fā)現(xiàn)一種長達(dá)2厘米的巨型細(xì)菌，擁有龐大的基因組！
3、膨化法與微生物發(fā)酵對豆粕營養(yǎng)價值的影響