CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，用于抵御外來(lái)核酸的入侵，如噬菌體和質(zhì)粒。CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類，其中III型系統(tǒng)因其獨(dú)特的機(jī)制和能夠同時(shí)切割入侵者的RNA和DNA而受到關(guān)注。III型系統(tǒng)進(jìn)一步分為多個(gè)亞型，其中III-E型系統(tǒng)與其他亞型存在顯著差異，其效應(yīng)蛋白gRAMP與一個(gè)類似半胱氨酸蛋白酶的TPR-CHAT結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成Craspase復(fù)合物，但其具體的免疫機(jī)制尚不清楚。研究人員利用冷凍電鏡技術(shù)解析了gRAMP-crRNA復(fù)合物以及Craspase復(fù)合物與靶標(biāo)RNA（CTR和NTR）結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到原子級(jí)別。研究人員還通過(guò)體外RNA切割實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)以及細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（Bioscreen C）等多種方法，研究了Craspase復(fù)合物的功能和作用機(jī)制。Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀被用于細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，并提供了實(shí)時(shí)、高通量的細(xì)菌生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)，還幫助研究人員評(píng)估了III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的抗病毒效果，為理解其免疫機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。研究發(fā)現(xiàn)Craspase復(fù)合物由gRAMP和TPR-CHAT組成，gRAMP包含多個(gè)Cas7樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Cas11樣結(jié)構(gòu)域，而TPR-CHAT包含一個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CHAT結(jié)構(gòu)域。Craspase復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明，TPR-CHAT與gRAMP的Cas7.2結(jié)構(gòu)域相互作用，鎖定crRNA的5'標(biāo)簽區(qū)域。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)Craspase復(fù)合物結(jié)合與crRNA互補(bǔ)的靶標(biāo)RNA（CTR）時(shí)，TPR-CHAT的蛋白酶活性被激活，能夠特異性地切割輔助蛋白Csx30。這種切割事件會(huì)觸發(fā)一種稱為“自殺性感染”的抗病毒策略，即細(xì)胞通過(guò)自我犧牲來(lái)阻止病毒的傳播。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀被用于細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。使用非誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌（大腸桿菌，攜帶編碼gRAMP-RNA、CHAT和Csx30-Csx31-SbRpoE的質(zhì)粒）或陰性對(duì)照（攜帶相應(yīng)空載體的大腸桿菌）。將這些細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋至最終OD600 nm為0.4的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補(bǔ)充了氨芐青霉素、卡那霉素和氯霉素。每個(gè)180μL的培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)100孔板中，每個(gè)孔中加入18μL的噬菌體裂解液（或18μL的SM緩沖液作為未感染對(duì)照），最終噬菌體λ的感染復(fù)數(shù)（MOI）為4和0.1。向每個(gè)孔中加入2μL的10 mM IPTG，使最終IPTG濃度達(dá)到0.1 mM。感染實(shí)驗(yàn)以三份重復(fù)進(jìn)行，每份重復(fù)來(lái)自單獨(dú)的過(guò)夜培養(yǎng)物。將蜂窩平板置于Bioscreen C中，37°C下振蕩培養(yǎng)。每15分鐘測(cè)量一次OD600 nm的吸光度，以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。Bioscreen C儀器能夠在同一實(shí)驗(yàn)中同時(shí)處理多個(gè)樣本，提高了實(shí)驗(yàn)效率，使得研究人員能夠快速獲得大量數(shù)據(jù)，從而更準(zhǔn)確地評(píng)估不同條件下的細(xì)菌生長(zhǎng)和抗病毒效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Craspase復(fù)合物通過(guò)識(shí)別靶標(biāo)RNA的非互補(bǔ)性來(lái)激活其蛋白酶活性。Csx30的特異性切割是觸發(fā)自殺性感染的關(guān)鍵步驟，這一過(guò)程需要Csx31和SbRpoE的參與。該系統(tǒng)通過(guò)自殺性感染機(jī)制來(lái)抵御病毒侵染，為理解原核生物的免疫機(jī)制提供了新的視角，并為開(kāi)發(fā)新型抗病毒工具提供了可能的途徑。通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)，并利用噬菌體λ進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，證明了該系統(tǒng)能夠有效抵御噬菌體的侵染。Csx30、Csx31和SbRpoE在抗病毒活性中起著關(guān)鍵作用。缺失這些組分或使用非靶向的CRISPR陣列會(huì)顯著降低或消除對(duì)噬菌體的保護(hù)效果。
圖1、gRAMPcrRNA的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。（A）Candidatus Scalindua brodae中g(shù)RAMP的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。Cas7.1–7.4和Cas11結(jié)構(gòu)域分別以洋紅色、黃色、灰色、粉紅色和綠色著色。（B）gRAMP-crRNA的整體結(jié)構(gòu)。gRAMP的域的顏色如（A）所示。crRNA的顏色為亮粉色和海洋色，分別用于間隔區(qū)和重復(fù)區(qū)。標(biāo)記了Cas7.4中的未建模插入域。（C）gRAMP的單獨(dú)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)標(biāo)記為Cas11結(jié)構(gòu)域。（D）crRNA結(jié)合的特寫視圖。標(biāo)記了Cas7.1-7.3結(jié)構(gòu)域的拇指和crRNA中的扭結(jié)核苷酸。（E-G）gRAMP的Cas7.1/7.2結(jié)構(gòu)域與crRNA的核苷酸（1）–（4）和crRNA（F）的（5）–（10）或（11）–（18）之間的相互作用。紅色虛線表示極相互作用。（H）gRAMP-crRNA及其突變體的靶RNA切割。DInsertion表示插入結(jié)構(gòu)域（殘基1,031-1,388）缺失并被GSG（甘氨酸-絲氨酸甘氨酸）接頭取代的gRAMP-crRNA。
圖2、gRAMP-crRNA-TR和RNA切割機(jī)制的結(jié)構(gòu)。（A）crRNA-TR雙鏈體的示意圖。實(shí)驗(yàn)中使用的crRNA和TR核苷酸用線條表示。TR是石板色的。crRNA和TR的建模核苷酸如結(jié)構(gòu)所示。不可見(jiàn)的核苷酸呈灰色。剪刀表示卵裂部位。（B）gRAMP-crRNA-TR的整體結(jié)構(gòu)。TR的顏色與（A）相同。（C）gRAMP-crRNA（深灰色）和gRAMP-crRNA-TR（B）的結(jié)構(gòu)疊加。Cas11結(jié)構(gòu)域的區(qū)域以圓圈突出顯示。（D）（C）結(jié)構(gòu)對(duì)齊內(nèi)Cas11結(jié)構(gòu)域區(qū)域的特寫圖。（E）gRAMP-crRNA和gRAMP-crRNA-TR中獨(dú)立Cas11結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)對(duì)齊。（F）gRAMP-crRNA-TR結(jié)構(gòu)中Cas11區(qū)域的特寫視圖，其中Cas11結(jié)構(gòu)域在靜電模型中是彩色的。（G）兩個(gè)切割位點(diǎn)gRAMP和TR之間的詳細(xì)相互作用。紅色虛線表示極相互作用。（H）gRAMP-crRNA及其突變體的靶RNA切割損害間隔區(qū)TR結(jié)合。標(biāo)記了代表位點(diǎn)1和2切割的產(chǎn)物條帶。（I）gRAMP-crRNA的靶RNA切割及其在兩個(gè)切割活性位點(diǎn)發(fā)生突變的突變體。
圖3、Craspase的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。（A）Craspase的整體結(jié)構(gòu)。gRAMP-crRNA的顏色如圖1B所示。TPR和CHAT結(jié)構(gòu)域的TPR-CHAT分別為橙色和青色。（B）Craspase中TPR-CHAT的整體結(jié)構(gòu)，顏色如（A）。兩個(gè)活性位點(diǎn)殘基以棒狀顯示。（C和D）gRAMP與TPR-CHAT的TPR域（C）和CHAT域（D）之間的詳細(xì)交互。（E）gRAMP-crRNA與TPR-CHAT及其突變體結(jié)合的MST測(cè)定。顯示了來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的單個(gè)值。
圖4、III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫機(jī)制。A）Craspase復(fù)合物中TPR-CHAT切割的靶標(biāo)RNA依賴性Csx30。TR/NTR/CTR RNA分子、TPR-CHAT、gRAMP-crRNA和Csx30以0.5、0.3、0.3和1.5 mM的濃度添加。（B和C）靶標(biāo)RNA依賴性Csx30與Craspase或其突變體在TPR-CHAT的活性位點(diǎn)發(fā)生突變。（D）III-E型CRISPR-Cas縱子可防止噬菌體。顯示了在表達(dá)來(lái)自Candidatus Scalinduabrodae的III-E CRISPR-Cas縱子型基因的大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞上接種l噬菌體的效率。該實(shí)驗(yàn)已獨(dú)立重復(fù)3次，并顯示了具有代表性的結(jié)果。（E）表達(dá)III-E CRISPR-CAS型縱子的五個(gè)基因的大腸桿菌細(xì)胞或?qū)φ沾竽c桿菌細(xì)胞（無(wú)系統(tǒng)）的大腸桿菌細(xì)胞的液體培養(yǎng)物的生長(zhǎng)曲線（Bioscreen）。細(xì)胞在37C下用l噬菌體感染。細(xì)菌在時(shí)間0以4或0.1的MOI感染。（F）III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的激活是有毒的。將編碼指定質(zhì)粒的細(xì)胞以10倍連續(xù)稀釋接種在溶原肉湯（LB）-瓊脂上，在沒(méi)有誘導(dǎo)或誘導(dǎo)表達(dá)的條件下接種。
圖5、Craspase-TR和Craspase-NTR的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（A）與TR（彩色板巖）結(jié)合的Craspase（如圖3A所示）的整體結(jié)構(gòu)。（B）Craspase（深灰色）和Craspase-TR（顏色如A所示）的結(jié)構(gòu)疊加。（C）（B）中結(jié)構(gòu)疊加中與Cas11結(jié)構(gòu)域相鄰的兩個(gè)環(huán)的特寫圖。Craspase和Craspase-TR的顏色如（B）。（D）Craspase-NTR中crRNA-NTR雙鏈體的示意圖。實(shí)驗(yàn)中使用的crRNA和NTR核苷酸用線條表示。NTR為深藍(lán)色。不可見(jiàn)的核苷酸呈灰色。（E）與NTR（深藍(lán)色）結(jié)合的Craspase的整體結(jié)構(gòu)。
總結(jié)
本研究主要是關(guān)于一種新型的CRISPR-Cas系統(tǒng)——III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫機(jī)制研究。研究人員通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)方法，揭示了該系統(tǒng)中Craspase復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征以及其在抗病毒防御中的作用機(jī)制。在III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)中，Cas效應(yīng)蛋白（gRAMP）與一個(gè)TPR-CHAT（tetratricopeptide repeat-Caspase HetF associated with TPRS）結(jié)合形成Craspase（CRISPR引導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶）。然而gRAMP的結(jié)構(gòu)特征以及該系統(tǒng)的免疫機(jī)制尚不清楚。在此，研究人員解析了gRAMP-crRNA以及gRAMP:crRNA:靶標(biāo)RNA的結(jié)構(gòu)，同時(shí)解析了Craspase以及Craspase與靶標(biāo)RNA（CTR或NTR）復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。重要的是，NTR和CTR的3'反標(biāo)簽區(qū)域結(jié)合在Craspase的兩個(gè)不同通道中，且CTR的非互補(bǔ)3'反標(biāo)簽?zāi)軌蛘T導(dǎo)TPR-CHAT發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，從而別構(gòu)激活其蛋白酶活性，進(jìn)而切割輔助蛋白Csx30。這種切割會(huì)觸發(fā)III-E型系統(tǒng)的自殺性感染作為抗病毒策略。本研究不僅揭示了Craspase復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征，還闡明了其在III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)中的作用機(jī)制，特別是靶標(biāo)RNA如何通過(guò)非互補(bǔ)性激活蛋白酶活性。研究揭示了III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)通過(guò)自殺性感染來(lái)抵御病毒侵染的獨(dú)特機(jī)制，為理解原核生物的免疫機(jī)制提供了新的視角。這些發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)新型抗病毒工具和基因編輯技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)，特別是在設(shè)計(jì)能夠特異性切割RNA的工具方面具有重要意義。Bioscreen C儀器能夠?qū)崟r(shí)記錄細(xì)菌在不同時(shí)間點(diǎn)的OD600 nm吸光度，從而反映細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)，評(píng)估抗病毒效果，通過(guò)比較攜帶CRISPR-Cas系統(tǒng)的細(xì)菌與攜帶空載體的對(duì)照細(xì)菌在噬菌體感染后的生長(zhǎng)差異，這使得研究人員能夠動(dòng)態(tài)觀察細(xì)菌在感染噬菌體后的生長(zhǎng)變化，以及III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)噬菌體感染的防御效果。
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