為了探索抗噬菌體重組鈍齒棒桿菌的應(yīng)用可行性,對(duì)重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的穩(wěn)定性以及其對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組質(zhì)粒在鈍齒棒桿菌中具有較好的穩(wěn)定性,它在鈍齒棒桿菌中的存在對(duì)重組菌株的早期生長(zhǎng)有些影響,但未影響重組菌株的谷氨酸產(chǎn)生量。
鈍齒棒桿菌是產(chǎn)生谷氨酸的菌株之一,其不同衍生株在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。然而,由于發(fā)酵生產(chǎn)的規(guī)?；瓦B續(xù)性,生產(chǎn)中的菌種極易感染噬菌體,所以噬菌體污染一直是影響谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。雖然通過(guò)改進(jìn)生產(chǎn)工藝,改善衛(wèi)生條件,控制生產(chǎn)環(huán)節(jié),噬菌體污染現(xiàn)象有所減輕,但仍時(shí)常發(fā)生[1-2]。為了解決谷氨酸發(fā)酵中的噬菌體污染問(wèn)題,利用質(zhì)粒攜帶的cglⅠ基因復(fù)合體構(gòu)建了抗噬菌體鈍齒棒桿菌基因工程菌,證實(shí)了cglⅠ基因復(fù)合體在鈍齒棒桿菌中的抗噬菌體功能活性[3]。由于構(gòu)建抗噬菌體基因工程菌的策略采用的是質(zhì)粒表達(dá)外源基因,而且表達(dá)的外源基因是限制修飾(RM)系統(tǒng)基因復(fù)合體,所以重組質(zhì)粒以及其所攜帶的RM在鈍齒棒桿菌中的行為如何尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為此,本文對(duì)重組質(zhì)粒在鈍齒棒桿菌中的穩(wěn)定性以及其對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響進(jìn)行了研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株鈍齒棒桿菌T6-13(野生型)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,含有質(zhì)粒pJL23-cglⅠ的重組鈍齒棒桿菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[3]。
1.1.2噬菌體5株噬菌體AS-I V3C44～ASI V3C48購(gòu)自武漢病毒研究所。
1.2方法
1.2.1菌株培養(yǎng)鈍齒棒桿菌T6-13(野生型)和重組鈍齒棒桿菌培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(固體或液體),需要時(shí)添加50μL/mL卡那霉素。
1.2.2噬菌體裂解液的制備具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。
1.2.3噬菌體效價(jià)測(cè)定具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。噬菌體效價(jià)(pfu/mL)=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。
1.2.4噬菌體抗性檢測(cè)采用平板空斑法,成斑率(Efficiency of plaquing,EOP)計(jì)算方法：成斑率EOP=抗性菌株中噬菌體成斑數(shù)/敏感菌株中噬菌體成斑數(shù)，敏感菌株的EOP等于1。
1.2.5菌株傳代[6]在LB/Km-平板上劃線接種重組鈍齒棒桿菌,30℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落,連續(xù)劃線接種傳代100次。將傳代次數(shù)為1、10、20、30、……80、90、100的平板4℃保存。
1.2.6質(zhì)粒分離穩(wěn)定性測(cè)定[6]從不同傳代次數(shù)(1、10、20、30、……80、90、100)的LB/Km-平板上,用無(wú)菌牙簽分別挑取100個(gè)單菌落,分別在LB/Km-和LB/Km+平板對(duì)應(yīng)位置上劃短線,30℃過(guò)夜培養(yǎng)。計(jì)數(shù)不同代次重組菌株在LB/Km-和LB/Km+平板上的生長(zhǎng)數(shù),計(jì)算重組菌株在無(wú)Km選擇壓力條件下質(zhì)粒的丟失率。質(zhì)粒穩(wěn)定性(%)=(LB/Km+平板上的生長(zhǎng)數(shù))/(LB/Km-平板上的生長(zhǎng)數(shù))×100%。
1.2.7質(zhì)粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性測(cè)定[6]從不同傳代次數(shù)(原代、20、40、60、80、100)的LB/Km-平板上,用無(wú)菌牙簽分別挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,30℃過(guò)夜培養(yǎng)后,采用噬菌體抗性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組菌株質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
1.2.8生長(zhǎng)曲線分析與測(cè)定
以野生菌株作對(duì)照,測(cè)定重組菌株的生長(zhǎng)曲線,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。
1.2.9谷氨酸測(cè)定
重組菌株與野生菌株(對(duì)照)分別搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h,從20 h起開始取樣,每隔4 h取樣1次,取樣時(shí)間分別設(shè)為20、24、28、32、36、40、44、48 h。采用大腸埃希菌L-谷氨酸脫羧酶解法使谷氨酸分解成CO2氣體,用微量呼吸檢壓儀定量測(cè)定產(chǎn)生的CO2量,根據(jù)反應(yīng)方程式計(jì)算出谷氨酸含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。
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