1.2.6生物學(xué)特性研究
1.2.6.1菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定
取菌株LV1 24～48 h培養(yǎng)液，以1%接種量（約2.0×106CFU·mL-1）接種MRS肉湯，置37℃厭氧培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌株培養(yǎng)液的OD值。以無(wú)菌MRS肉湯作空白對(duì)照，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.2.6.2培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
取菌株LV1 24～48 h培養(yǎng)液，以1%接種量（約2.0×106CFU·mL-1）接種MRS肉湯，分別置20、25、30、35、40、45、50、55℃條件下厭氧培養(yǎng)18 h，以無(wú)菌MRS肉湯作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定各培養(yǎng)溫度下菌株培養(yǎng)液的OD值。以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，比較菌株生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.2.6.3培養(yǎng)液pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
取菌株LV1 24～48 h培養(yǎng)液，以1%接種量（約2.0×106CFU·mL-1）接種MRS肉湯，pH值分別調(diào)整為2、3、4、5、6、7、8、9，置37℃厭氧培養(yǎng)18 h，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定各pH條件下菌株培養(yǎng)液的OD值。以無(wú)菌MRS作空白對(duì)照，以pH為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，比較菌株生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.2.6.4安全性試驗(yàn)
將80只小白鼠隨機(jī)分為高劑量組（3×1011CFU·kg-1bw）、中劑量組（2×1011CFU·kg-1bw）、低劑量組（1×1011CFU·kg-1bw）和生理鹽水對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。在灌服試驗(yàn)菌前8 h至灌服后4 h禁食，但不禁水。取純化菌接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，4 000 r·min-1離心15 min，棄上清，用生理鹽水調(diào)整菌數(shù)，各組均一次性灌服。灌服后每天觀察，并記錄小白鼠臨床表現(xiàn)，死亡鼠剖檢，觀察14 d后處死存活小鼠，剖檢，出現(xiàn)異常變化的器官制作組織切片。
2結(jié)果
2.1形態(tài)特征
通過(guò)厭氧分離純化，得到革蘭氏陽(yáng)性、短桿狀、兩端鈍圓、成鏈，無(wú)芽孢桿菌1株，菌株編號(hào)為L(zhǎng)V1，菌落特性為圓形、中等大小、邊緣整齊、表面光滑、乳白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm。
2.2生化鑒定結(jié)果
2.2.1乳酸桿菌屬的生化鑒定結(jié)果
厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)等均為陰性，初步確定分離株LV1為乳酸桿菌屬。
2.2.2乳酸桿菌種的生化鑒定結(jié)果
研究共應(yīng)用了15種糖醇微量生化反應(yīng)管。其中，葡萄糖、纖維二塘、乳糖、麥芽糖、松三糖、核糖、蔗糖、葡萄糖酸鹽、山梨醇、七葉苷、水楊素等均為陽(yáng)性，阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、甘露醇等均為陰性，符合干酪乳桿菌生化特征，確定分離株LV1為干酪乳桿菌。
2.3 PCR鑒定結(jié)果
凝膠成像結(jié)果表明，分離株LV1在727 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，確定LV1為干酪乳桿菌，與生化鑒定結(jié)果相符，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
2.4生物學(xué)特性結(jié)果
2.4.1菌株生長(zhǎng)曲線
菌株LV1在0～4 h為生長(zhǎng)延遲期，4～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD620為1.041，12～24 h為穩(wěn)定期，24 h以后進(jìn)入衰亡期。。
2.4.2培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LV1在培養(yǎng)溫度為25～45℃均能生長(zhǎng)，其中適宜生長(zhǎng)溫度為30～40℃，最適生長(zhǎng)溫度為35～37℃，具體結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2培養(yǎng)溫度對(duì)菌株LV1生長(zhǎng)的影響
2.4.3培養(yǎng)液pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LV1在培養(yǎng)液初始pH3～8條件下均能生長(zhǎng)，其中適宜pH為5～7，最適pH為6～7，具體結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3培養(yǎng)液pH對(duì)菌株LV1生長(zhǎng)的影響
2.4.4安全性試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的精神、食欲、行為、糞便等均未見(jiàn)異常，試驗(yàn)鼠未出現(xiàn)死亡。觀察14 d后處死存活小鼠，剖檢內(nèi)臟器官均未見(jiàn)異常變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干酪乳桿菌LV1安全。
3討論
諸多動(dòng)物源乳酸桿菌已被分離，益生作用得到廣泛證實(shí)，而驢源乳酸桿菌的分離及生物學(xué)特性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，研究首次從健康驢新鮮糞便中分離到干酪乳桿菌1株，編號(hào)為L(zhǎng)V1，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為研發(fā)驢用乳酸桿菌微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。
驢源干酪乳桿菌LV1，安全，無(wú)致病性，可用于飼用微生態(tài)制劑的研發(fā)。適宜生長(zhǎng)溫度和pH范圍廣，在25～30℃的低溫發(fā)酵環(huán)境中均可生長(zhǎng)，適用于寒地低溫環(huán)境發(fā)酵。此外，該菌株具有耐酸特性，在pH3.0條件下仍可生長(zhǎng)。上述良好的生物學(xué)特性表明，干酪乳桿菌LV1在研發(fā)驢用乳酸桿菌微生態(tài)制劑方面具有廣闊前景。
目前，在驢微生態(tài)研發(fā)領(lǐng)域仍缺乏系統(tǒng)、科學(xué)的研究。研究從驢腸道微生態(tài)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、生物質(zhì)資源利用角度出發(fā)，分離、鑒定了驢源腸道乳酸桿菌，研究其生物學(xué)特性，為下一步研究驢用生態(tài)制劑產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。推動(dòng)驢傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式向高效、綠色、無(wú)公害、環(huán)保的生態(tài)養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變，促進(jìn)我國(guó)驢養(yǎng)殖業(yè)的健康、循環(huán)、可持續(xù)發(fā)展。
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