2.2土壤細菌群落的多樣性分析
Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)是反映微生物群落豐富度和多樣性的重要指標。6塊試驗田不同月土壤細菌的Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)見圖5，CK與EG不同月的Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)見表1。根據(jù)圖5中Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)隨時間的變化規(guī)律表明：4月CK和EG物種多樣性與豐度高于其他4個月，在5月EG物種多樣性與豐度最低。由表1可知，CK與EG的Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)在4?8月份存在一定差異，6月CK與EG對應的4個α多樣性指數(shù)差異不大，5月CK與EG對應的4個多樣性指數(shù)差異最大，且EG的α多樣性指數(shù)遠小于CK，從而導致5月CK的物種多樣性指數(shù)遠高于EG。通過CK與EG在4?8月物種多樣性指數(shù)變化表明稻田環(huán)溝引入蟹后可以明顯改變土壤中細菌群落的物種多樣性與豐度，其中4月和8月可以提高細菌群落的物種多樣性與豐度，5月降低細菌群落的物種多樣性，而6月對細菌群落的物種多樣性與豐度的影響不明顯。
2.3細菌群落結構組成
2.3.1門水平分類下土壤細菌群落結構組成
在門水平下，將試驗田CK和EG在4?8月相對豐度排名前20的土壤細菌繪制柱形圖(圖6A)。細菌群落主要由變形菌門(Proteobacteria,96.64%?23.19%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,19.85%?0.35%)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota,17.48%?0.01%)、放線菌門(Actinomycetota,10.99%?0.79%)、綠屈撓菌門(Chloroflexi,10.84%?0.21%)、厚壁菌門(Firmicutes,8.75%?0.65%)、出芽單胞菌門(Gemmatimonadota,7.17%?0.81%)、酸桿菌門(Acidobacteria,5.02%?0.32%)、藍菌門(Cyanobacteria,4.35%?0.01%)和疣微菌門(Verrucomicrobiota,3.49%?0.02%)、等構成。其中最優(yōu)勢菌門為變形菌門，較優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和脫硫桿菌門。
圖3不同月份CK和EG組土壤6種理化指標的變化特征
圖4土壤理化因子相關性分析
圖5不同月份試驗田土壤細菌群落α多樣性指數(shù)
表1不同月份試驗田土壤細菌群落α多樣性指數(shù)
圖6不同月份土壤細菌群落相對豐度
CK與EG的優(yōu)勢菌門具有顯著的差異。CK在4?8月優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門、脫硫桿菌門和綠彎菌門，其中變形菌門相對豐度處于絕對優(yōu)勢，但在4?8月變形菌門的相對豐度呈現(xiàn)下降趨勢。EG在4?8月變形菌門相對豐度處于絕對優(yōu)勢，在5月其相對豐度最高(96.64%)，綠彎菌門在4?8月其相對豐度呈現(xiàn)增加趨勢(除5月外)。與CK相比，引入蟹后的EG在4?8月相對豐度排名前20的細菌累積相對豐度都高于CK，說明引入蟹后能明顯改變稻田土壤微生物群落結構和物種豐度。
對相對豐度前10的細菌進行相關性分析，研究表明變形菌門與其菌門呈現(xiàn)負相關關系，與擬桿菌門、脫硫桿菌門和厚壁菌門的相關系數(shù)分別為?0.608、?0.541和?0.602，且呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。除變形菌門外，擬桿菌門與其他菌門呈現(xiàn)正相關關系，與疣微菌門、藍細菌門和酸桿菌門的相關系數(shù)分別為0.385、0.422和0.417，都呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。
2.3.2屬水平分類下土壤細菌群落結構組成
在屬水平下，將試驗田EG與CK在4?8月相對豐度排名前10的土壤細菌繪制柱形圖(圖6B)。試驗田土壤細菌群落相對豐度前10的細菌屬分別為Pseudomonas(84.11%?2.69%)、Thiobacillus(33.18%?0.31%)、Methanosaeta(20.12%?0.14%)、Unspecified_Bacteria(17.18%?1.55%)、Unspecified_Prolixibacteraceae(9.87%?0.02%)、Unspecified_Anaerolineaceae(9.06%?0.07%)、WCHB1_32(7.02%?0.07%)、Hydrogenophaga(5.21%?0.25%)、Sphingomonadaceae(5.19%?0.05%)、Unspecified_ Burkholderiales(5.06%?0.05%)和Unspecified_ Comamonadaceae(3.28%?0.01%)。CK與EG土壤細菌群落結構存在一定的相關性也有各自特征。4?8月EG中Pseudomonas相對豐度始終高于CK，且EG中Pseudomonas相對豐度一直處于較高水平，特別在5?7月。CK中相對豐度較高的菌屬為Thiobacillus、Unspecified_Bacteria、Methanosaeta和WCHB1_32菌屬。在4?8月EG中Thiobacillus的相對豐度都低于CK。通過CK與EG屬水平排名前10的菌屬相對豐度對比表明，引入蟹后會提高EG土壤細菌中Pseudomonas菌屬的相對豐度，同時也會降低Thiobacillus和Methanosaeta菌屬的相對豐度。
2.4細菌群落結構比較
利用基于Bray-Curtis距離的NMDS方法評估不同種養(yǎng)模式及不同月土壤細菌群落的相似性，結果見圖7。Stress<0.2表明圖形具有較好的表現(xiàn)意義，R>0表示分組有效，P<0.05為顯著性差異，橢圓是質心周圍的95%置信區(qū)間。由圖8可知，ANOSIM統(tǒng)計檢驗顯示，CK與EG土壤細菌群落的組成存在顯著差異(Stress=0.080<0.2,P-value=0.001,R=0.706)，同時CK和EG土壤細菌群落與不同采樣月有顯著差異(Stress=0.080<0.2,P-value=0.014,R=0.176。結果表明引入蟹后對細菌群落結構組成的影響遠大于采樣月的影響。
2.5不同種養(yǎng)模式下土壤微生物群落結構與理化因子的相關性
采用冗余分析(RDA)對試驗田土壤理化因子和土壤細菌門水平主要物種進行關聯(lián)分析。通過計算方差膨脹因子系數(shù)VIF值，表明7個理化因子膨脹系數(shù)均小于5。在門水平上將理化因子與土壤排名前10的優(yōu)勢細菌群落進行RDA分析(圖8A)。環(huán)境因子的長度表征對土壤細菌的影響，長度越長，相關性越高，影響越大；當環(huán)境因子與菌門的夾角為余弦值時，余弦絕對值越大，則影響程度越高，值為正表示正相關，為負表示負相關；若正交，則不相關。蒙特卡洛檢驗結果表明，TN是影響土壤細菌群落結構變化的關鍵因子。
圖7土壤細菌群落結構在不同區(qū)域和不同月份的非度量多維尺度分析(NMDS)與ANOSIM分析
圖8理化因子與土壤微生物群落組成(門水平)相關分析A：RDA分析.B：相關性熱圖.
對土壤細菌群落中相對豐度排前10的優(yōu)勢菌門與土壤理化因子進行Spearman相關性分析(圖8B)，結果表明所選7個理化因子中TDS、TN、TP、AP和SOM與相對豐度前10的菌門具有顯著性差異，其中AP與放線菌門和綠屈撓菌門呈現(xiàn)極顯著負相關關系(P<0.001)，相關系數(shù)分別為?0.636和?0.746。TN主要影響變形菌門、擬桿菌門、脫硫桿菌門和疣微菌門，且與它們都呈負相關關系。pH和TK與相對豐度前10的優(yōu)勢菌門均無顯著性差異，與細菌主要呈正相關關系，且與優(yōu)勢菌門的相關性系數(shù)r<0.4。
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