2.9噬菌體A149的治療評(píng)價(jià)
按照?qǐng)D7A的流程進(jìn)行噬菌體A149對(duì)小鼠腸道VRE定殖的治療；對(duì)治療后小鼠糞便中的腸球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)以評(píng)價(jià)A149的治療效果，結(jié)果如圖7B所示，經(jīng)過混合抗生素處理和V583感染后，V583可在小鼠腸道實(shí)現(xiàn)短期穩(wěn)定的定殖(第1、2天)，糞便中腸球菌載量可達(dá)109 CFU/g左右。在使用噬菌體A149治療之后，治療組與對(duì)照組(BHI處理)在2 d后(第3、4天)均有顯著差異，治療組在第二天可降低1.3個(gè)數(shù)量級(jí)的V583載量。但V583不能繼續(xù)在對(duì)照組的小鼠腸道中實(shí)現(xiàn)高載量的穩(wěn)定定殖，在V583感染后第5?7天發(fā)生顯著降低；治療組與對(duì)照組在第5?7天的細(xì)菌載量無顯著性差異。該結(jié)果證實(shí)A149可在感染初期有效降低V583在小鼠腸道中的定殖。
圖7噬菌體A149對(duì)小鼠腸道VRE感染的治療評(píng)價(jià)A：噬菌體A149對(duì)小鼠腸道VRE感染的治療流程圖。?12、?10、?9、?3分別表示耐萬古霉素Efs V583感染前12 d、10 d、9 d以及3 d。Abx為AntiBiotics簡(jiǎn)稱。B：噬菌體A149治療后糞便中的糞腸球菌計(jì)數(shù)。
小結(jié)
噬菌體A149基因組不含抗生素抗性基因和毒力基因，在體外可有效抑制糞腸球菌生長(zhǎng)達(dá)11 h，對(duì)所測(cè)試的糞腸球菌具有86.4%的裂解能力(51/59)，在小鼠腸道感染模型中可降低糞腸球菌約1.3個(gè)數(shù)量級(jí)。
3、討論
多重耐藥性腸球菌的感染是當(dāng)前臨床上一個(gè)突出的治療挑戰(zhàn)，其中，院內(nèi)感染最為常見的腸球菌是屎腸球菌和糞腸球菌。相較于屎腸球菌，糞腸球菌的毒力往往更強(qiáng)，引起菌血癥的同時(shí)也可能伴有心內(nèi)膜炎[18]。因此，耐藥糞腸球菌尤其是耐萬古霉素糞腸球菌的感染嚴(yán)重威脅著人類健康和公共衛(wèi)生安全。噬菌體作為一種歷史悠久的天然抗菌劑，在后抗生素時(shí)代再次受到人們的重視，在治療多重耐藥菌感染的方面具有巨大的應(yīng)用潛力；已有臨床案例證實(shí)，噬菌體可成功治療多重耐藥性細(xì)菌感染[19]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)糞腸球菌噬菌體的研究相對(duì)有限，亟須進(jìn)一步篩選和研究其噬菌體的生物學(xué)特性，為建立糞腸球菌感染的噬菌體防控策略提供科學(xué)基礎(chǔ)。
本研究分離出一株針對(duì)耐萬古霉素糞腸球菌V583的噬菌體A149，其最佳感染復(fù)數(shù)為0.001，潛伏期短(≤5 min)，暴發(fā)量高(約912 PFU/cell)，在生長(zhǎng)特性上優(yōu)于之前報(bào)道的腸球菌短尾噬菌體Ideix和vB_EfaP_IME195[9,20]。A149可在較寬的溫度范圍(20?50℃)和pH范圍(4.0?10.0)穩(wěn)定存活，基因組不含抗生素抗性基因和毒力基因，具有應(yīng)用于治療糞腸球菌感染的潛力。此外，A149對(duì)糞腸球菌菌株的裂解譜為86.4%(51/59)，在種內(nèi)具有良好的廣譜性；對(duì)屎腸球菌(0/5)、單核增生李斯特氏菌(0/2)、金黃色葡萄球菌(0/2)和大腸桿菌(0/2)等均無裂解效果，具有良好的特異性。一般認(rèn)為，短尾噬菌體的裂解譜較肌尾噬菌體(Myoviridae)和長(zhǎng)尾噬菌體(Siphoviridae)窄[21]，但噬菌體A149表現(xiàn)出相對(duì)較廣的裂解譜，有研究也表明腸球菌短尾噬菌體Ump比肌尾噬菌體CCS1和長(zhǎng)尾噬菌體CCS2、CCS3、CCS4表現(xiàn)出更廣泛的裂解譜[22]，表明腸球菌短尾噬菌體的裂解譜可能相對(duì)較廣。
VRE腸道定殖是住院患者院內(nèi)感染的主要來源，因此我們模擬住院患者抗生素治療后耐藥腸球菌大量增殖造成腸道感染的特征構(gòu)建了小鼠模型，并測(cè)定了噬菌體A149對(duì)VRE腸道定殖的清除效果。相較于對(duì)照組，A149在治療后第2天可顯著降低V583定殖，減少約1.3個(gè)數(shù)量級(jí)，具有良好的體內(nèi)治療效果。但A149并未實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道內(nèi)V583的完全清除，噬菌體抗性菌的產(chǎn)生是其中的一個(gè)原因，體外抑菌曲線也顯示在11 h之后抗性菌開始進(jìn)入生長(zhǎng)期(圖6)。有研究表明噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生是噬菌體不能根除腸球菌腸道感染的原因之一[23]，證實(shí)了噬菌體抗性菌株是噬菌體療法的局限性之一。本研究中的糞腸球菌V583是耐萬古霉素糞腸球菌，所以具有抗生素和噬菌體雙重抗性的細(xì)菌可能已被選擇出來，并成為優(yōu)勢(shì)感染的菌群，進(jìn)一步增加了治療難度。有研究表明，一些耐藥菌株在獲得噬菌體抗性的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)對(duì)部分抗生素的再次敏感，因此噬菌體與抗生素的聯(lián)合使用具有協(xié)同抗菌作用，是一種值得探究的聯(lián)合抗菌策略[24]。此外，噬菌體“雞尾酒”療法通過復(fù)配不同類型或不同受體的噬菌體形成組合，可以在一定程度上有效消除噬菌體抗性，并具備比單株噬菌體更強(qiáng)的殺菌能力，是噬菌體療法的主要研究方向之一[25]。今后的研究應(yīng)致力于篩選更多的糞腸球菌噬菌體，并開發(fā)高效、廣譜的噬菌體“雞尾酒”療法，為耐藥糞腸球菌感染的防控提供新的策略。
4、結(jié)論
本研究從污水樣本中分離出一株可高效裂解耐萬古霉素糞腸球菌V583的短尾噬菌體A149，經(jīng)過對(duì)其形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)特性研究以及體內(nèi)外抑菌實(shí)驗(yàn)，表明該噬菌體具有較廣的裂解譜以及較好的抑菌作用，是治療耐萬古霉素糞腸球菌的有效生物資源，對(duì)于糞腸球菌感染的“無抗”防控具有重要的意義。
相關(guān)新聞推薦
1、生長(zhǎng)曲線分析儀監(jiān)測(cè)突變體在抗生素利福平處理后的生長(zhǎng)恢復(fù)情況（一）
2、原生動(dòng)物而非噬菌體主導(dǎo)對(duì)細(xì)菌的長(zhǎng)期下行調(diào)控（三）
3、豬乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、IFA、PCR、免疫印跡試驗(yàn)鑒定（二）
4、不同濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)、電導(dǎo)率生、物被膜形成、泳動(dòng)聚集能力的影響（二）