2結(jié)果與分析
2.1調(diào)理牛排腐敗菌分離鑒定結(jié)果
對(duì)腐敗末期調(diào)理牛排的微生物進(jìn)行分離純化，結(jié)果如表2所示。從6種傳統(tǒng)培養(yǎng)基中共分離純化得到10株菌，其中PDA、STAA培養(yǎng)基各1株，VRBA、CFC、PCA、MRS培養(yǎng)基各2株。但是，采用培養(yǎng)基分離篩選出的菌株往往不能代表微生物的真實(shí)分布情況，也無(wú)法僅憑此判斷優(yōu)勢(shì)腐敗菌。因此，優(yōu)勢(shì)腐敗菌的確定還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
表2調(diào)理牛排腐敗菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及鑒定結(jié)果
2.2 PCR-DGGE分析調(diào)理牛排菌群變化
DGGE指紋圖譜上的1個(gè)水平條帶代表1個(gè)微生物類群，條帶越多表示樣品中的微生物多樣性越豐富。其中，條帶越亮，則表示該種菌的數(shù)量相對(duì)越多。調(diào)理牛排作為冷鮮食品，其最佳食用期為2～3 d。從第3天開(kāi)始，牛肉品質(zhì)開(kāi)始下降，表面略微變綠，質(zhì)地松散，回彈緩慢，處于次鮮肉，已不適宜消費(fèi)者食用。從4 d開(kāi)始，肉制品底部滲出惡臭血水，不能食用。Sul等在研究牛肉的貯藏期時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似的變化。因此，提取調(diào)理牛排6 d內(nèi)的總菌落DNA，進(jìn)行DGGE，分析菌落的變化及微生物演替過(guò)程。
圖1顯示，在4℃低溫貯藏過(guò)程中，微生物菌群具有一定的差異性和動(dòng)態(tài)演替。在貯藏初期（1～3 d），樣品還在可食用范圍內(nèi)，樣品中的初始菌相并不復(fù)雜，微生物數(shù)量不多，這說(shuō)明冷藏起到了暫時(shí)性的保鮮效果，延緩了細(xì)菌的繁殖速率。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，條帶由少變多，在末期還出現(xiàn)了一些新的條帶。但是，條帶1、2、3貫穿整個(gè)貯藏期，且亮度并未隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而變暗。在后期，條帶4、5、6、7、8開(kāi)始逐漸由暗變亮，這說(shuō)明冷藏能夠在一定程度上抑制這些微生物生長(zhǎng)，但并不能完全抑制。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌效果逐漸減弱，微生物快速繁殖，導(dǎo)致調(diào)理牛排加速腐敗變質(zhì)。因此，確定條帶1、2、3為調(diào)理牛排的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。
圖1調(diào)理牛排腐敗期細(xì)菌16S rDNA V6～V8區(qū)基因的PCR-DGGE指紋圖譜
2.3 DGGE分離鑒定結(jié)果
如表3所示，在DGGE譜圖中，條帶較弱的DNA未檢測(cè)出菌株類別，只檢測(cè)到菌屬水平。其中條帶1、2、3分別為深藍(lán)紫色桿菌、惡臭假單胞菌和熱殺索絲菌，即調(diào)理牛排中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。先前的研究結(jié)果表明，假單胞菌屬是導(dǎo)致冷鮮肉產(chǎn)生不良?xì)馕逗透瘮∽冑|(zhì)的主要菌群。
表3 PCR-DGGE條帶的基因片段序列比對(duì)結(jié)果
2.4 3種植物精油的抑菌性能評(píng)價(jià)
2.4.1抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果
通過(guò)測(cè)定3種植物精油對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌圈直徑，初步篩選出具有優(yōu)良抑菌效果的植物精油。由表4可知，CEO對(duì)3株腐敗菌均有明顯抑菌性。其中，對(duì)熱殺索絲菌的抑制效果最為顯著（P＜0.05），抑菌圈直徑為13.900 mm。CSEO的抑菌效果稍弱，對(duì)深藍(lán)紫桿菌的抑菌性顯著高于其他菌（P＜0.05）。而B(niǎo)PEO對(duì)3株菌均無(wú)抑菌效果。因此，可以初步判斷CEO的抑菌性最強(qiáng)。吳天琳比較60種植物精油對(duì)立枯絲核菌、核盤菌、灰葡萄孢等6種植物病原真菌的體外抗菌活性，發(fā)現(xiàn)CEO對(duì)6株菌的抑制率最高，均達(dá)到100%；CSEO抑菌性稍弱，抑制率最高為69.54%；黑胡椒精油抑菌性最弱，抑菌性最高為55.28%。
表4 CEO、CSEO和PBEO對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌圈直徑
注：—.沒(méi)有抑菌圈；同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。
綜上，可以初步判斷，CEO的抑菌效果最強(qiáng)。這可能是由于其主要成分為丁香酚、百里香酚、肉桂醛和石竹烯等芳香環(huán)和酚類物質(zhì)，能夠與膜蛋白相互作用，誘導(dǎo)生物分子從細(xì)胞內(nèi)部流失，影響電子傳遞、酶活性和蛋白質(zhì)合成，從而抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。有相關(guān)研究報(bào)道，酚類物質(zhì)在不同體積濃度下對(duì)微生物的抑菌機(jī)制有所差異。在低體積濃度下，酚類物質(zhì)的抑菌性能主要通過(guò)抑制酶活體現(xiàn)，而在高體積濃度下則通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性實(shí)現(xiàn)高效抗菌。CSEO的主要成分是黃酮類、生物堿和花青素，通過(guò)攻擊細(xì)菌細(xì)胞膜，引起細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)、ATP和DNA的泄漏。而深藍(lán)紫色桿菌和惡臭假單胞菌均屬于革蘭氏陰性菌，細(xì)胞膜外層的肽聚糖作為細(xì)胞保護(hù)結(jié)構(gòu)，從而減緩了CSEO的抑菌性。
2.4.2 MIC與MBC測(cè)定結(jié)果
MIC和MBC為抑制病原微生物繁殖或殺滅病原微生物的最小藥物濃度。由表5可知，總體來(lái)看，CEO的MIC和MBC最低，2μL/mL的精油添加量就具備明顯的抑菌效果。3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌中，CSEO對(duì)深藍(lán)紫色桿菌的抑菌效果最強(qiáng)，這與上述抑菌圈結(jié)果一致。在精油添加量為最大體積濃度（32μL/mL）時(shí)，CSEO與惡臭假單胞菌、熱殺索絲菌的細(xì)菌培養(yǎng)液在培養(yǎng)16～24 h后仍然渾濁，說(shuō)明在此精油添加量下，CSEO沒(méi)有發(fā)揮出抑菌效果。通過(guò)抑菌圈、MIC和MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明確，BPEO對(duì)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌均未表現(xiàn)出抑菌效果，所以通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)一步比較CSEO、CEO的抑菌性能強(qiáng)弱。
表5 CEO、CSEO、BPEO對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的MIC和MBC
注：—.在最高精油添加量下試管溶液渾濁。
2.4.3優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)曲線
OD600 nm可以直接或間接反映樣品中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。由圖2可知，未被CEO處理的各優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)情況符合典型的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。由圖2a可知，MIC和2MIC體積濃度的CEO在8 h內(nèi)就能抑制90%的深藍(lán)紫色桿菌生長(zhǎng)，并且在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)使其維持較低的生長(zhǎng)活性。相比之下，2MIC體積濃度的CEO具有更強(qiáng)的抑制效果，在12～20 h還能持續(xù)降低細(xì)菌的OD600 nm。從圖2b可以明顯觀察到，惡臭假單胞菌的細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)為空白對(duì)照組＞MIC處理菌懸液＞2MIC處理菌懸液，與熱殺索絲菌一致（圖2c），都證明CEO能夠有效抑制優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)。
圖2 CEO對(duì)深藍(lán)紫色桿菌（a）、惡臭假單胞菌（b）、熱殺索絲菌（c）生長(zhǎng)曲線的影響
由圖3a可知，2MIC體積濃度的CSEO能夠作用于深藍(lán)紫色桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使其生長(zhǎng)繁殖受到抑制。抑菌圈實(shí)驗(yàn)表明，CSEO對(duì)熱殺索絲菌和惡臭假單胞菌具有低敏抑菌性。但在進(jìn)行MIC和MBC實(shí)驗(yàn)時(shí)，即使在最大精油添加量下，CSEO對(duì)2株優(yōu)勢(shì)腐敗菌均未表現(xiàn)出抑菌性。因此，以最大精油添加量（32μL/mL）進(jìn)行細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究CSEO對(duì)這2株菌的生長(zhǎng)抑制效果。由圖3b、c可知，添加精油的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組一致，無(wú)抑菌性。綜上所述，針對(duì)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌，CEO為抑菌性最強(qiáng)的植物精油。
圖3 CSEO對(duì)深藍(lán)紫色桿菌（a）、惡臭假單胞菌（b）、熱殺索絲菌（c）生長(zhǎng)曲線的影響
3結(jié)論
通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)基分離腐敗菌株，結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)對(duì)調(diào)理牛排腐敗貯藏過(guò)程中微生物的消長(zhǎng)規(guī)律和菌群變化進(jìn)行檢測(cè)，明確優(yōu)勢(shì)腐敗菌為深藍(lán)紫色桿菌、惡臭假單胞菌和熱殺索絲菌。針對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌，再通過(guò)抑菌圈、MIC、MBC和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線從CEO、CSEO和BPEO 3種香辛料植物精油中篩選出抑菌性最強(qiáng)的植物精油為CEO，為后續(xù)調(diào)理牛排的防腐保鮮提供了參考。
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