圖2、Rif對一類新型超敏突變體的殺菌作用。a，rpoB突變體對Rif的敏感性和抗性圖譜。b，a中數(shù)據(jù)的火山圖。終止密碼子為灰色。c，超敏突變體中Rif的MIC（P=1.2×10?4，從左到右為2.1×10?3）。d，用80μg ml-1 Rif處理1小時后恢復(fù)1小時后，來自野生型（WT）和rpoB T525D RNAP在高度轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）周圍ChIP-seq信號的薈萃分析。e，80μg ml-1 Rif處理1小時后超敏突變體的接種效率（n=6;P=5.7×10?4、1.8×10?4）。f，用80μg ml-1 Rif處理1小時后，通過TUNEL染色測量超敏突變體的DNA損傷。TUNEL陽性細(xì)胞是在超過99%的未處理細(xì)胞中檢測到的超過信號的細(xì)胞百分比（n=4;P=1.3×10?2、4.7×10?3）。g，80μg ml-1 Rif處理1小時后recA或recBCD敲除菌株中超敏突變體的接種效率（n=4，P=5.3×10-2,7.3×10-3,4.2×10-5,5.7×10-5）。h，用80μg ml-1 Rif處理1小時后，使用SLR-qPCR測量的啟動子和基因體上每10千克堿基（kb）的DSB數(shù)（P=2.4×10-3、1.7×10-5、1.2×10-4、3.7×10-3、2.4×10-5、4.2×10-5）。i，超敏突變體在含有復(fù)制蛋白dnaC的溫度敏感等位基因的PC2背景中的接種效率（P=1.8×10-3、7.6×10-5）。通過將細(xì)胞移至42°C 1.5小時，然后用80μg ml-1 Rif處理30分鐘來阻斷復(fù)制。
圖3、利福平結(jié)合位點突變體的生長特性及與平均位置特性的進(jìn)化保守性比較。a,在25°C下生長的5-氟尿嘧啶敏感突變體的生長曲線。b,按5-氟尿嘧啶敏感性分層的rpoB突變體在25°C和42°C下的生長曲線。c,在25°C下生長的野生型細(xì)胞添加亞抑制濃度的雙環(huán)霉素的生長曲線。除非另有說明，生長曲線代表n=3個生物學(xué)獨立實驗的平均值，誤差條表示95%置信區(qū)間。
圖4、使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀對利福平超敏感突變體（hypersensitive mutants）在80μg/mL利福平處理1小時后的恢復(fù)情況進(jìn)行了生長曲線分析。測量了這些突變體在經(jīng)過利福平處理后的生長恢復(fù)情況，以評估其對藥物的敏感性。
圖5、rpoB 515Y突變體與野生型細(xì)胞在添加0、0.1或1μg/mL胸腺嘧啶（thymidine）條件下的生長曲線。數(shù)值代表2個生物學(xué)重復(fù)的平均值。
總結(jié)
本研究是關(guān)于抗生素結(jié)合位點的高分辨率研究，特別是針對利福平（Rifampicin，Rif）與大腸桿菌（Escherichia coli）RNA聚合酶（RNAP）結(jié)合位點的詳細(xì)遺傳學(xué)分析。研究團(tuán)隊通過多路復(fù)用基因組工程技術(shù)，生成并表征了涵蓋大腸桿菌RNA聚合酶整個利福平結(jié)合位點的760個單氨基酸突變體。這些突變體覆蓋了rpoB基因的510-537和563-572位置，這些位置與利福平的結(jié)合有關(guān)。
研究者使用MAGE技術(shù)結(jié)合測序，不受正向選擇和低突變率的限制，能夠以極高的效率和特異性引入和監(jiān)測細(xì)菌染色體上感興趣區(qū)域的突變。通過這種方法，研究者生成了涵蓋利福平結(jié)合位點每個位置所有可能替代的RNAP突變體集合，并提供了利福平結(jié)合相互作用的詳細(xì)遺傳圖譜。
Bioscreen C全自動生長曲線分析儀用于監(jiān)測不同突變體在利福平（Rifampicin）處理下的生長恢復(fù)情況。通過設(shè)置不同的時間點和處理條件，研究者能夠詳細(xì)觀察突變體在藥物處理后的生長延遲和恢復(fù)情況。Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在本研究中提供了高通量、自動化和精確的生長曲線監(jiān)測功能，極大地提高了實驗效率和數(shù)據(jù)的可靠性，為研究利福平結(jié)合位點的突變體提供了重要的技術(shù)支持。本研究成果提供了對利福平結(jié)合位點的深入理解，揭示了RNAP的突變?nèi)绾斡绊懣股氐慕Y(jié)合和細(xì)菌的生理反應(yīng)，為開發(fā)新的抗生素和理解細(xì)菌耐藥性提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
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