現(xiàn)代醫(yī)學依靠抗生素通過破壞細菌細胞內(nèi)的靶標來治療細菌感染。一旦進入這些細胞，抗生素就會與特定酶靶標上的某些位點結合，從而阻止細菌生長。編碼這些靶標的基因會自然發(fā)生隨機變化（突變），在某些情況下會使抗生素難以附著在靶標上，從而使細菌產(chǎn)生耐藥性。因此，隨著時間的推移，抗生素使用得越多，細菌種群進化出對現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生耐藥性的突變體的可能性就越大，人們就越迫切地需要新的方法來防止抗生素治療過時。幾十年來科學家們一直在研究耐藥性突變，希望通過相關機制來指導設計克服耐藥性的新療法。然而，這種努力一直受到限制，因為自然發(fā)生的耐藥性突變只占可能發(fā)生的突變（完整的突變空間）的一小部分，而且迄今為止，大多數(shù)藥物結合位點突變都被忽視了。為了應對這一挑戰(zhàn)，來自美國紐約大學格羅斯曼醫(yī)學院的研究人員應用了一種名為多重自動化基因組工程（Multiplex Automated Genome Engineering，MAGE）的技術產(chǎn)生了大腸桿菌中涉及抗生素利福平（rifampicin）結合的RNA聚合酶（RNAP）的全部突變清單，其中在這種細菌中，利福平附著在它的RNAP上并使其失效。研究人員利用自然界中存在的20種氨基酸的每一種分別替換了構成大腸桿菌利福平結合位點的38個氨基酸殘基，從而制造出了760種獨特的RNAP突變體。他們?nèi)缓笤诎ɡＦ教幚碓趦?nèi)的不同條件下測試了這系列突變體的生長情況。這些發(fā)現(xiàn)L521Y和T525D這兩種突變體對利福平非常敏感。這種抗生素不僅能阻止這些突變體生長，還能幾乎消滅這兩種突變細菌種群。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
Bioscreen用于監(jiān)測不同突變體在利福平（Rifampicin）處理下的生長恢復情況。通過設置不同的時間點和處理條件，能夠詳細觀察突變體在藥物處理后的生長延遲和恢復情況。由于Bioscreen可以同時檢測3個不同波長的OD值變化。這不僅能夠監(jiān)測微生物的生長曲線，還可以同時檢測其他相關物質的生成或降解動態(tài)變化曲線。除了監(jiān)測細菌的生長，Bioscreen C全自動生長曲線分析儀還可以同時檢測抗生素對細菌生長的影響。Bioscreen能夠在15°C至65.0°C的范圍內(nèi)精確控制培養(yǎng)溫度，且溫度變化的精度可達0.1°C。這使得研究者能夠在不同的溫度條件下進行實驗，以評估溫度對突變體生長的影響。在本研究中還用于評估不同溫度下快速RNAP突變體的生長優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，這些突變體在低溫下生長更快，且在25°C時達到更高的OD值。
實驗結果
研究者發(fā)現(xiàn)了一個α螺旋區(qū)域（rpoB 521-526），其中的突變可以顯著增強或破壞利福平的結合。在這個區(qū)域，他們發(fā)現(xiàn)了單氨基酸突變體，這些突變體通過增加利福平的結合親和力，將利福平從抑菌劑轉變?yōu)闅⒕鷦?，通過誘導致命的DNA斷裂實現(xiàn)這一轉變。這些致命的DNA斷裂是復制依賴的，表明利福平通過在啟動子處引起有害的轉錄-復制沖突來殺死細菌。發(fā)現(xiàn)了其他結合位點突變，這些突變大大增加了RNAP的速度?？焖俚腞NAP耗盡細胞中的核苷酸，改變了細胞對不同抗生素的敏感性，并在低溫下提供了生長優(yōu)勢。通過映射自然rpoB序列多樣性，研究者發(fā)現(xiàn)，改變RNAP屬性或賦予藥物抗性的功能性利福平結合位點突變在自然界中頻繁發(fā)生。一些對利福平超敏感的突變體，這些突變體在利福平存在下生長受到抑制，并且在DNA損傷修復突變體中對利福平的敏感性增加。這些RifHS突變體在利福平處理后顯示出更高的DNA斷裂水平，并且在缺乏雙鏈斷裂（DSB）修復機制的細胞中，利福平的殺菌效果增強。研究還發(fā)現(xiàn)了一些快速RNAP突變體，這些突變體對5-氟尿嘧啶（5FU）和雙環(huán)霉素（BCM）敏感。這些突變體的RNAP具有更高的轉錄延伸速率和更低的暫停頻率，導致細胞內(nèi)核苷酸池的耗竭，從而增加了對靶向核苷酸生物合成的抗生素的敏感性。
圖1、在Rif結合位點生成所有單個密碼子替換。a，大腸桿菌RNAP的rpoB亞基內(nèi)的Rif結合位點（藍色），在下圖中放大（PDB 5UAC）。b，突變池生成的示意圖。MAGE寡核苷酸設計為在Rif結合位點內(nèi)生成760個單密碼子突變體（20個取代×38個位點）的飽和庫。c，適應性篩選后在時間點0（T0）和時間點1（T1）生成的突變豐度的代表性熱圖。對于篩選數(shù)據(jù)的分析，通過計算log2（T1 fitness/T0）倍數(shù)變化，在T1和T0之間進行歸一化。行對應于rpoB位置510–537和563–572;列對應于氨基酸。白色方塊表示野生型殘基。d，藥物敏感性和耐藥性篩選示意圖。在LB中無法生長的突變體被指定為弱突變體，而僅在藥物中無法生長的突變體被認為對藥物敏感。通過將“T1藥物”突變豐度標準化為“T1適應性”，即log2（T1藥物/T1適應性），可以分離藥物特異性作用。
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