2.5沒食子酸對溶藻弧菌生物被膜的清除作用
不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌成熟生物被膜清除的影響如圖5所示。與對照組相比，1/2MIC、1MIC和2MIC的沒食子酸溶液能顯著清除成熟的溶藻弧菌生物被膜(P<0.05)，清除率分別為54.5%、67.54%和68.01%。結果表明，1/2MIC以上濃度的沒食子酸對溶藻弧菌成熟的生物被膜清除作用明顯，且清除作用隨其濃度的增加而增強。
2.6沒食子酸對溶藻弧菌泳動能力的影響
a：1/2MIC；b：1/4MIC；c：未添加。
a:1/2MIC;b:1/4MIC;c:No addition.
沒食子酸對溶藻弧菌泳動的影響如圖6、7所示。1/2MIC和1/4MIC濃度的沒食子酸對溶藻弧菌泳動能力有顯著的抑制作用(P<0.05)，較對照組分別減少60.41%(P<0.05)和51.78%(P<0.05)，2MIC和1MIC濃度的沒食子酸能完全抑制溶藻弧菌的生長，平板上未見細菌生長。結果表明，1/4MIC以上濃度的沒食子酸能顯著抑制溶藻弧菌的泳動能力，且抑制作用隨濃度的增加而增強。
2.7沒食子酸對溶藻弧菌聚集能力的影響
不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌聚集能力的影響如圖8所示。陽性對照組細菌間的聚集能力為44.08%，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC濃度的沒食子酸能顯著降低溶藻弧菌的聚集能力，聚集能力分別被降至37.41%、25.70%、19.19%和18.68%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。
討論
隨著生活水平的提高，人們對于食品安全的關注度越來越高，2021年1月農業(yè)農村部印發(fā)了《關于加強水產養(yǎng)殖用投入品監(jiān)管的通知》，其中指出開展水產養(yǎng)殖用獸藥、飼料和飼料添加劑相關違法行為三年專項整治，在全國試行水產養(yǎng)殖用投入品使用白名單制度。但目前合規(guī)的水產動物疾病防治藥物較少，加之養(yǎng)殖模式和病原區(qū)系特征的不斷變化，尋找綠色高效的防治藥物成為當前水產病害防治的研究熱點之一。
沒食子酸作為一種多酚類化合物，廣泛存在于植物中，也可通過生物或化學合成方式大量獲得，具有較好的抗菌活性。研究證實，沒食子酸對遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)、柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)等４種水產動物致病菌的抑菌圈直徑可達25~30 mm。研究結果顯示，沒食子酸對副溶血弧菌的MIC為3 mg/mL。本研究結果顯示，沒食子酸對溶藻弧菌的MIC和MBC分別為4 mg/mL和8 mg/mL，MBC/MIC為2，說明沒食子酸對溶藻弧菌具有良好的殺菌作用；生長曲線測定結果表明，4 mg/mL以上濃度的沒食子酸能完全抑制溶藻弧菌生長，2 mg/mL的沒食子酸明顯抑制溶藻弧菌的快速生長，生長平臺期菌液濃度明顯低于陽性對照組，提高沒食子酸藥物濃度可縮短藥物的抑菌作用時間，說明沒食子酸對溶藻弧菌的抑制效果呈劑量依賴性，因此，選用沒食子酸抑制溶藻弧菌生長時，應選用4 mg/mL及以上濃度方能達到良好的抑菌作用。
當細菌的細胞壁和細胞膜遭到破壞時，細胞膜通透性增高，細胞內容物流出，細菌胞外的AKP活性和電導率會顯著升高。研究發(fā)現，沒食子酸能使高敏感菌單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)出現凹陷、破損、細胞原生質泄漏。地榆提取物能破壞多重耐藥大腸埃希氏菌(multidrug-resistant Escherichia coli)的細胞壁，顯著提高胞外的AKP含量。本研究中1、2、4、8 mg/mL濃度的沒食子酸能在2 h內破壞溶藻弧菌的細胞壁，導致AKP漏出；沒食子酸能使溶藻弧菌培養(yǎng)物的電導率增加，說明沒食子酸也可破壞溶藻弧菌細胞膜的完整性，導致通透性增加，且破壞程度呈劑量依賴性。
生物被膜是由細菌分泌的胞外多聚物(EPS)組成，如蛋白質、胞外多糖、脂質和細胞外DNA，生物被膜有利于微生物黏附，能提高細菌對外界不良壞境的抵抗能力，同時增加細菌對抗菌藥物的抗性。多項研究指出，細菌的運動性和聚集能力在細菌早期粘附、生物被膜形成和細菌定殖過程中發(fā)揮著重要作用，細菌通過運動相互聚集，借助EPS粘附更多的游離菌，從而更加有利于生物被膜的形成，同時細菌間的聚集可促進其粘附，使生物被膜結構更加堅固。研究發(fā)現，多酚類物質能通過破壞細胞壁和細胞膜、減少生物被膜形成、干擾細菌運動和聚集能力等發(fā)揮對細菌的抑制效果。沒食子酸可誘導大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性發(fā)生不可逆變化。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的運動能力和生物被膜形成。
蝦殼殼聚糖–表沒食子兒茶素沒食子酸酯共聚物(COS-EGCG)0.256 mg/mL能顯著抑制單增李斯特菌的泳動和群集。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的沒食子酸能顯著抑制溶藻弧菌的運動性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且沒食子酸溶液濃度越高，溶藻弧菌的運動性和聚集能力越低；同時，沒食子酸能高效抑制生物被。生物被膜是由細菌分泌的胞外多聚物(EPS)組成，如蛋白質、胞外多糖、脂質和細胞外DNA，生物被膜有利于微生物黏附，能提高細菌對外界不良環(huán)境的抵抗能力，同時增加細菌對抗菌藥物的抗性。多項研究指出，細菌的運動性和聚集能力在細菌早期粘附、生物被膜形成和細菌定殖過程中發(fā)揮著重要作用，細菌通過運動相互聚集，借助EPS粘附更多的游離菌，從而更加有利于生物被膜的形成，同時細菌間的聚集可促進其粘附，使生物被膜結構更加堅固。研究發(fā)現，多酚類物質能通過破壞細胞壁和細胞膜、減少生物被膜形成、干擾細菌運動和聚集能力等發(fā)揮對細菌的抑制效果。沒食子酸可誘導大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性發(fā)生不可逆變化。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的運動能力和生物被膜形成。蝦殼殼聚糖–表沒食子兒茶素沒食子酸酯共聚物(COS-EGCG)0.256 mg/mL能顯著抑制單增李斯特菌的泳動和群集。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的沒食子酸能顯著抑制溶藻弧菌的運動性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且沒食子酸溶液濃度越高，溶藻弧菌的運動性和聚集能力越低；同時，沒食子酸能高效抑制生物被膜的形成，4 mg/mL和8 mg/mL濃度的沒食子酸對溶藻弧菌生物被膜形成的抑制率可達77.80%和83.26%，對成熟溶藻弧菌生物被膜的清除率分別為67.54%和68.01%，表明沒食子酸可能通過抑制溶藻弧菌的運動和聚集能力來抑制生物被膜的形成。生物被膜消除后，細菌對抗菌藥物的抵抗力將顯著下降，當沒食子酸與抗生素聯用時，可增加后者在大腸埃希氏菌菌體內累積而表現出抗生素增效劑作用。沒食子酸也可通過破壞細胞膜完整性和調控ica基因家族而發(fā)揮抗菌作用，這種獨特的抗菌機制幾乎不會誘導細菌耐藥性的產生。因此，沒食子酸不僅可作為一種抗菌效果較好的藥物添加劑使用，還可能作為一種抗菌增效劑聯合抗生素進行疾病的治療。
結論
沒食子酸對溶藻弧菌的抑菌效果較好，可以通過破壞溶藻弧菌細胞壁，增加細胞膜通透性，抑制生物被膜的形成，清除成熟的生物被膜，通過抑制溶藻弧菌的運動和聚集能力抑制或殺滅溶藻弧菌，此研究結果將為水產動物弧菌感染性疾病的防治提供新的思路。
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