Bio-5'-AMP合成反應(yīng)
如先前所述2?進(jìn)行BirA催化的體外蛋白質(zhì)生物素化活性測定，略有修改。使用ExPASY Tools網(wǎng)站根據(jù)蛋白質(zhì)序列計算的消光系數(shù)確定蛋白質(zhì)濃度。測定體系包含50mM Tris-HCl(pH 8)、5mM Tris-(2-羧乙基)膦、5mM MgCl?、20μM生物素、5μM ATP加16.5 nM[α-32P]ATP、100 mM KCl和2μM BirA蛋白。每個反應(yīng)混合物在37°C孵育30分鐘。對于每個測試的BirA蛋白，使用兩個相同的管，在30分鐘反應(yīng)結(jié)束時，向每對管中的一個加入AccB87（50μM），另一個管不作處理。管子再在37°C孵育15分鐘。將每種反應(yīng)混合物1μl點(diǎn)樣到微晶纖維素薄層色譜板上，用異丁酸-NH?OH-水（66:1:33）展開2?。薄層色譜板干燥10小時，暴露于磷屏成像板，并使用Fujifilm FLA-3000磷屏成像儀和Fujifilm Image Gauge軟件（Mac OS版本3.4）可視化。
質(zhì)譜分析
使用MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀測量BirA催化的AccB87生物素化水平。反應(yīng)體系包含100μM AccB-87、3μM BirA、100μM生物素、1 mM ATP、10mM MgCl?、100mM KCl、5mM tris-(2-羧乙基)膦，溶于50mM Tris-HCl(pH 8)中，在37°C孵育16小時。在進(jìn)行低分辨率基質(zhì)輔助激光解吸/電離分析之前，將混合物在25 mM乙酸銨中透析并凍干至干。使用FlexAnalysis 3.3軟件包（Bruker Daltonics）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用軟件包的內(nèi)置功能對光譜進(jìn)行平滑處理和基線校正。
電泳遷移率變動分析
如先前所述2?,3?,31進(jìn)行凝膠遷移實驗，以探測BirA1_LL（和BirA2_LL）蛋白與乳酸乳球菌和豬鏈球菌2的bioY啟動子的結(jié)合。通過退火兩個互補(bǔ)的寡核苷酸制備兩組DNA探針（bioY_LL和bioY_SS）（bioY_LL-F:5'-CAA ATA ATA AAA TTA ACA GTT AAC CTA AAT TTG ATT TTA GGG TTA CTG TTT GAT ATG-3'；bioY_LL-R:5'-5'-CAT ATC AAA CAG TAA CCC TAA AAT CAA ATT TAG GTT AAC TGT TAA TTT TAT TAT TTG-3'）。在結(jié)合緩沖液（Roche）中，將純化的BirA1_LL（和BirA2_LL）蛋白按一系列稀釋度與地高辛標(biāo)記的DNA探針（約0.2 pmol）混合。如果需要，加入生物素酰-5'-AMP配體。DNA/蛋白質(zhì)混合物在天然7%PAGE上進(jìn)行分離。
生物信息學(xué)分析
使用ClustalW2程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）對BirA的兩種直系同源物和BirA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行多序列比對，最終輸出通過ESPript 2.2程序（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）給出。使用中性網(wǎng)絡(luò)啟動子預(yù)測服務(wù)器（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。使用CPHmodels 3.2服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels）進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，使用適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)模板：BirA_ec（PDB:1HXD）用于BirA1_LL；嗜熱氫菌BirA（PDB:3EFS）用于BirA2_LL；ECF型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的S組分（PDB:4DVE）用于乳酸乳球菌的兩個BioY直系同源物。
3H-生物素轉(zhuǎn)運(yùn)
乳酸乳球菌在THB中過夜培養(yǎng)。取1 ml樣品離心沉淀，用PBS洗滌三次，并接種到補(bǔ)充了1 nM或1μM生物素的基本培養(yǎng)基中。樣品生長4.5小時，離心沉淀，并用PBS洗滌三次以去除外部生物素。然后將沉淀物重懸于含有0.5%葡萄糖的PBS中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)測定?，并使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法對每個樣品中的總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。對于轉(zhuǎn)運(yùn)測定，樣品在30°C下與0.5μM3H-生物素一起孵育0.5、1、2、5、30或60分鐘。通過用冰PBS稀釋來終止反應(yīng)，并將細(xì)菌收集在0.45μm過濾器上。然后將過濾器與閃爍液混合，并使用Packard閃爍計數(shù)器計數(shù)DPM。
結(jié)果與討論
乳酸乳球菌中生物素代謝基因的冗余
與其近親人畜共患病原體豬鏈球菌1?類似，乳酸乳球菌也是一種低GC革蘭氏陽性細(xì)菌，具有簡化基因組（GC百分比35.3%，2.37 Mb）。然而，令人意外的是，乳酸乳球菌的基因組織在生物素代謝背景下呈現(xiàn)基因重復(fù)和/或冗余。與豬鏈球菌僅編碼一個birA基因和一個bioY基因不同，乳酸乳球菌有兩個birA直系同源物（稱為birA1[L0191]和birA2[L0192]，表S1）和兩個bioY直系同源物（分別為bioY1[L24031]和bioY2[L1011]）。birA2基因編碼一個推定的“簡單”生物素蛋白連接酶（BPL），缺乏在推定的雙功能birA1中發(fā)現(xiàn)的N端DNA結(jié)合基序（圖1和2）。雖然存在多個birA和bioY同源物拷貝是非典型的，但在弗朗西斯菌屬中發(fā)現(xiàn)了兩個birA拷貝，在副球菌屬12中存在兩個不同的bioY直系同源物。除了birA和bioY的冗余外，乳酸乳球菌脂肪酸合成基因座內(nèi)也存在冗余（表S1）。乳酸乳球菌中存在三個fabG（3-氧?；?ACP還原酶）基因座，即fabG1（L0185）、fabG2（L27694）和fabG3（L1530）。值得注意的是，Wang和Cronan報道fabG2不是活躍的3-氧?；?ACP還原酶1?，表明這些fabG基因座可能在糖代謝中發(fā)揮作用。此外，乳酸乳球菌有兩個編碼3-羥?；?ACP脫水酶的基因座（fabZ[L0188]和fabZ1[L160425]）。乳酸乳球菌還有兩個脂肪酸降解（fad）基因（fadA[L25946]和fadD[L54546]），而鏈球菌屬的fad系統(tǒng)是隱性的。這些基因安排表明，與其近親豬鏈球菌相比，乳酸乳球菌的脂質(zhì)代謝（包括生物素利用）具有意想不到的復(fù)雜性。
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