植物內(nèi)生細(xì)菌是指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，并且與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的細(xì)菌。內(nèi)生細(xì)菌通過自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，主要表現(xiàn)在促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物抗性及提高植物修復(fù)能力等方面，例如，Microbacterium具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，Bacillus具有良好的生防潛力，Sphingomonas對(duì)植物有自我修復(fù)功能等。內(nèi)生菌對(duì)植物病害的防病作用通過產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)、產(chǎn)生水解酶、產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、內(nèi)生菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等途徑抑制病原菌的生長(zhǎng)。
據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，食用菌生產(chǎn)栽培過程中由于病蟲的危害，可導(dǎo)致減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)w粒無收。防治病蟲害最常見的方法就是化學(xué)藥劑，但是長(zhǎng)時(shí)間使用單一的化學(xué)藥劑會(huì)使得病蟲害的抗性增強(qiáng)和防治效果下降，而且藥品的殘留量大都會(huì)對(duì)人的身體健康造成威脅，也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染，因而針對(duì)病蟲害的生物防治近年來受到世界各地的高度重視。國(guó)內(nèi)外研究人員在內(nèi)生菌對(duì)于防治植物病害方面進(jìn)行了大量的研究，也取得了非常顯著的效果。本文選取對(duì)主要食用菌病原菌具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-A16，研究其生物學(xué)特性及其對(duì)3種食用菌病害的生防機(jī)制，為食用菌病蟲害的生物防治奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1供試菌株
1.1.1內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-A16該菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并篩選出，其對(duì)主要食用菌病原菌具有較好拮抗效果，初步鑒定為金黃短桿菌。
1.1.2供試食用菌病原菌疣孢病菌為疣孢霉（Mycogone perniciosa）；蛛網(wǎng)病菌為葡枝霉（Cladobotryum semicirculare）；油疤病菌為木棲柱孢霉（Scytalidium lignicola）。
1.2培養(yǎng)基及主要試劑
內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、水1000 mL，pH值7.0~7.2（液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）。
PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1000 mL。
主要試劑：所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3金黃短桿菌CT-A16的生物學(xué)特性
1.3.1培養(yǎng)特征和形態(tài)特征
取供試金黃短桿菌CT-A16接種于NA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2~3 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，包括菌體形狀和芽孢形態(tài)等重要鑒別特征。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)菌形態(tài)觀察方法參照東秀珠等的方法。
1.3.2最適溫度的測(cè)定
在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后將金黃短桿菌CTA16按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基試管中，分別置于15、20、25、30、35、40℃等6個(gè)溫度梯度下、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，以不接種金黃短桿菌CTA16的NB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值，以確定其生長(zhǎng)的最適溫度。
1.3.3最適pH值的測(cè)定在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)整液體培養(yǎng)基的初始pH值，使培養(yǎng)基pH值梯度為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。接種金黃短桿菌CT-A16于培養(yǎng)基后，在30℃下、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再測(cè)定OD600值，以確定其生長(zhǎng)的最適pH值。
1.3.4生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
儀器為Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀：在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，按1%的接種量接種金黃短桿菌CT-A16，在30℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)。以開始放搖床振蕩培養(yǎng)開始進(jìn)行第1次取樣（零小時(shí)取樣），測(cè)量其OD600值，以后隔2 h定時(shí)取樣，測(cè)定菌液的OD600值。
1.4金黃短桿菌CT-A16對(duì)主要食用菌病害的生防機(jī)制
1.4.1金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液的制備
取供試金黃短桿菌CT-A16，分別用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為100 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，再4℃，10000 r/min離心15 min，取得上清液。在無菌條件下，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后將所得濾液，即為金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液。
1.4.2金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液的制備
取供試金黃短桿菌CT-A16，分別用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為100 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，放入高壓滅菌鍋，121℃條件下滅菌30 min，即為金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液。
1.4.3金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用菌落生長(zhǎng)法測(cè)定金黃短桿菌CT-A16過濾液的抑菌活性，將上述金黃短桿菌CT-A16過濾液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加過濾液的PDA平板為對(duì)照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長(zhǎng)狀況，待對(duì)照CK滿板時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑，并計(jì)算相對(duì)抑制率。
相對(duì)抑制率/%=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%
1.4.4金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用菌落生長(zhǎng)法測(cè)定金黃短桿菌CT-A16滅菌液的抑菌活性，將上述金黃短桿菌CT-A16滅菌液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加滅菌液的PDA平板為對(duì)照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長(zhǎng)狀況，待對(duì)照（CK）滿板時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑，并計(jì)算相對(duì)抑制率。
1.4.5金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
取上述金黃短桿菌CT-A16過濾液，將過濾液按照20%、40%兩個(gè)比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長(zhǎng)成熟的3個(gè)病原菌的培養(yǎng)皿中加入無菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液，然后用移液槍將孢子懸浮液加入上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況，并計(jì)算相對(duì)抑制率。
1.4.6金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
取上述金黃短桿菌CT-A16滅菌液，將滅菌液按照20%、40%兩個(gè)比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長(zhǎng)成熟的3個(gè)病原菌的培養(yǎng)皿中加入無菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液。然后用移液槍將孢子懸浮液加入到上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況，并計(jì)算相對(duì)抑制率。
1.4.7金黃短桿菌CT-A16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響
將3個(gè)病原菌菌株（疣孢病菌、蛛網(wǎng)病菌、油疤病菌）和金黃短桿菌CT-A16分別轉(zhuǎn)接到不同的PDA平板上，并分別在適宜的溫度條件下培養(yǎng)2 d后，在無菌條件下去掉平板蓋，將接有病原菌的培養(yǎng)皿相對(duì)扣合，并用封口膜沿邊緣封口，防止揮發(fā)性物質(zhì)漏出。以不接金黃短桿菌CT-A16的PDA平板作為對(duì)照，置于28℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。觀察病原菌的菌絲生長(zhǎng)情況，并計(jì)算相對(duì)抑菌率。
1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)繪圖用Excel 2007，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用DPS V7.05軟件的相應(yīng)分析功能進(jìn)行。
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