2.2重組病毒的制備、純化和鑒定
2.2.1重組病毒的篩選
用質(zhì)粒小提中量試劑盒提取高純度轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pT-UL2-RFP，將質(zhì)粒濃縮為1μg/μL后，將該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體與DEV共轉(zhuǎn)染CEF，24 h后，即可在熒光顯微鏡下觀察到帶有紅色熒光的的梭形細胞，說明質(zhì)粒在該細胞中表達，待80%細胞產(chǎn)生病變后，收獲細胞并反復(fù)凍融3次，將其接種到長有新鮮CEF單層的六孔培養(yǎng)板中，用含5%血清、3%NaHCO3、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養(yǎng)液覆蓋，觀察熒光，挑取單個有紅色熒光的蝕斑，再接種到新的細胞上，經(jīng)過5輪篩選，所有的蝕斑都帶有紅色熒光，獲得純化的重組病毒(圖2)。
圖2表達紅色熒光的重組DEV病毒
2.2.2重組病毒的鑒定
用鑒定引物ORFC17F/ORFC17R對重組病毒進行PCR擴增鑒定，得到大小約為2000 bp的片段(圖3)，與理論值相符。
將PCR產(chǎn)物送北京華大基因生物公司測序，結(jié)果顯示重組病毒缺失UL2基因，且?guī)в蠷FP標(biāo)記基團。
2.3一步生長曲線繪制
重組病毒及其親本毒的一步生長曲線。圖4結(jié)果表明，親本毒接種CEF后48 h，病毒含量達到峰值106.5TCID50/0.1 mL，84 h上清樣品病毒含量達到峰值106.75TCID50/0.1 mL。而表達紅色熒光蛋白的重組病毒細胞的病毒含量在48 h達到峰值，為106.4TCID50/0.1 mL，上清樣品的病毒含量在84 h達到峰值，為106.83TCID50/0.1 mL，與親本毒無差異(P>0.05)。
圖4重組病毒rDEV-ΔUL2-RFP的一步生長曲線
2.4重組病毒的傳代穩(wěn)定性
重組病毒經(jīng)傳代12次，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光在1～12代均可穩(wěn)定表達，所有產(chǎn)生CPE的細胞均帶有紅色熒光(圖5)。重組病毒第5代、第10代、第12代PCR均擴增出2000 bp片段(圖6)。測序結(jié)果表明，RFP序列未出現(xiàn)變異。
圖5重組病毒的傳代穩(wěn)定性檢測
3討論與結(jié)論
本研究篩選并純化了表達RFP的UL2基因功能缺失的重組鴨腸炎病毒，并對其生物學(xué)進行初步研究。研究表明該重組病毒的生長特性與親本毒相似，并且可在CEF上連續(xù)穩(wěn)定傳代。與GFP相比，RFP在DEV中更穩(wěn)定，至少在UL2基因內(nèi)，RFP更適合重組DEV的反向篩選。
傳統(tǒng)同源重組技術(shù)常以GFP、RFP、LacZ等作為重組病毒篩選標(biāo)記基團，LacZ作為標(biāo)記基團其缺點是分子量較大，不便于啟動子克隆時重組質(zhì)粒的構(gòu)建，通過化學(xué)顯色，檢測靈敏度低，操作繁瑣；熒光蛋白如GFP、RFP分子量小，發(fā)光強，操作簡單，可直接在熒光顯微鏡下觀察，易于檢測，對基因功能、蛋白表達、定位示蹤等諸多研究發(fā)揮了重要作用。但是目前已有研究表明，GFP在重組病毒中不穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加易發(fā)生點突變或缺失，F(xiàn)ang等構(gòu)建表達GFP的北美1型豬繁殖與呼吸綜合征的感染性克隆，拯救出含有GFP的病毒粒子，當(dāng)病毒連續(xù)傳代至第7代時，發(fā)現(xiàn)GFP基因發(fā)生突變；孫瑩等研究顯示表達GFP的重組鴨瘟病毒，綠色熒光在1～5代可以穩(wěn)定表達，從第6代開始可觀察到少量沒有熒光的細胞病變，15～20代絕大部分細胞病變無綠色熒光，對重組DEV的篩選帶來極大困難。紅色熒光蛋白(RFP)出現(xiàn)較GFP稍晚，其可以激發(fā)和發(fā)射波長段也不同。本研究將RFP替代GFP，獲得了一株表達紅色熒光的重組DEV，且一步生長曲線表明RFP對DEV的生長無影響；RFP連續(xù)傳代12代，能夠穩(wěn)定表達且無突變。試驗證明RFP穩(wěn)定性更強，與研究報道一致。根據(jù)本實驗室在重組DEV篩選方面的經(jīng)驗，通常在10代以內(nèi)就能夠克隆純化到重組病毒，因此本研究僅將RFP連續(xù)傳代至12代，未進行更多的傳代。本研究結(jié)果對重組DEV的構(gòu)建、篩選具有很好的借鑒意義。
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