傳統(tǒng)的細(xì)菌治療在癌癥治療中面臨著安全性和有效性之間的平衡問(wèn)題。雖然一些細(xì)菌，如沙門氏菌，因其能夠在腫瘤微環(huán)境中選擇性增殖而被研究用于癌癥治療，但它們作為異源微生物，可能會(huì)引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致治療效果受限。此外如何確保細(xì)菌在腫瘤組織中的有效富集，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損害，也是一大挑戰(zhàn)。研究者們采用了液氮冷凍休克技術(shù)處理含有減毒沙門氏菌VNP20009的巨噬細(xì)胞。這種方法能夠在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下，使巨噬細(xì)胞失去活性，同時(shí)保持內(nèi)部細(xì)菌的活性。通過(guò)這種方式，細(xì)菌被有效地偽裝在巨噬細(xì)胞內(nèi)部，從而在避免初始免疫清除的同時(shí)，能夠被運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)冷凍休克處理的巨噬細(xì)胞（LNT MACS/VNP）能夠在腫瘤組織中實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的有效富集。這種偽裝策略減少了細(xì)菌被循環(huán)系統(tǒng)中的中性粒細(xì)胞清除的風(fēng)險(xiǎn)，并且由于巨噬細(xì)胞的自然趨向性，增強(qiáng)了細(xì)菌在腫瘤中的積累。此外這種策略還激活了腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)，包括增加抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量和減少免疫抑制細(xì)胞的數(shù)量。
本研究提供了一種新的策略，通過(guò)利用巨噬細(xì)胞作為載體，將減毒細(xì)菌有效地輸送到腫瘤組織中，同時(shí)激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。這種方法不僅提高了治療效果，而且減少了傳統(tǒng)細(xì)菌治療可能引起的副作用，為癌癥治療提供了新的可能性。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同條件下細(xì)菌（如減毒沙門氏菌VNP20009及其變體）在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。使用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀監(jiān)測(cè)不同菌株在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)條件。在兩次傳代培養(yǎng)后激活的VNP菌株被調(diào)整至OD600為1.0。然后，將10μL細(xì)菌懸浮液添加到1mL LB培養(yǎng)基中。充分混合后，將300μL溶液添加至Bioscreen C微孔板的孔中。將微孔板在37°C下孵育30小時(shí)，以30分鐘的間隔進(jìn)行連續(xù)OD600測(cè)量。通過(guò)連續(xù)測(cè)量培養(yǎng)液的吸光度（OD600），可以獲取細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，從而評(píng)估細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)階段。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)液氮冷凍休克處理含有減毒沙門氏菌VNP20009的巨噬細(xì)胞株，制備出“死亡”但“功能性”的沙門氏菌加載巨噬細(xì)胞。這些處理后的巨噬細(xì)胞保持了完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，失去了原有的致病性，而內(nèi)部的細(xì)菌保留了原有的生物活性，并能在體內(nèi)延遲釋放和增殖。這種“特洛伊木馬”策略有效避免了細(xì)菌免疫原性引起的中性粒細(xì)胞招募和激活，減少了細(xì)菌被中性粒細(xì)胞清除，增強(qiáng)了細(xì)菌在腫瘤中的富集效率。此外，這種策略還激活了腫瘤微環(huán)境，提高了抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞（包括M1型巨噬細(xì)胞和CD8+Teffs）的數(shù)量，減少了促腫瘤效應(yīng)細(xì)胞（包括M2型巨噬細(xì)胞和CD4+Tregs）的數(shù)量，并最終在皮下H22荷瘤小鼠模型中提高了抗腫瘤效果。
圖1、裝載VNP菌株的冷凍休克巨噬細(xì)胞的制備和表征。a)LNT MACS/VNP細(xì)胞制備過(guò)程示意圖。b)與VNP菌株（MACS+VNP）共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞（MACS）的明場(chǎng)圖片。赫斯特標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。紅色箭頭表示VNP菌株。比例尺=10μm。c)隨著細(xì)胞與菌株共培養(yǎng)的時(shí)間，MACS中細(xì)胞內(nèi)加載的活VNP菌株的數(shù)量以及形態(tài)完整的MACS的百分比發(fā)生變化（n=5）。d)Live MACS、Live MACS/VNP細(xì)胞和LNT MACS/VNP細(xì)胞的熒光圖像。FITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（綠色）；DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。紅色箭頭表示細(xì)胞內(nèi)VNP-RFP菌株。比例尺=20μm。e)活MACS/VNP和LNT MACS/VNP細(xì)胞的明場(chǎng)圖片。赫斯特標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。白色箭頭表示VNP菌株（表達(dá)紅色熒光蛋白的菌株）。比例尺=5μm。f)使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同細(xì)胞的形態(tài)。比例尺=5μm。g)顯示了LNT MACS和LNT MACS/VNP-RFP的相對(duì)平均熒光強(qiáng)度(MFI)。au，任意單位。h)Live MACS和LNT MACS增殖活性比較示意圖。i)Live MACS和LNT MACS的體內(nèi)增殖活性比較（右）。百分比值總結(jié)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)每組n=5只小鼠）。顯示了質(zhì)量生成的代表性解剖學(xué)觀察圖像（左）。
圖2、胞內(nèi)VNP菌株可由LNT MACS/VNP細(xì)胞釋放并保持其原有的生物活性。a，，活MACS/VNP和LNT MACS/VNP細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)活株數(shù)量的變化（左）（n=5）。顯示了代表性的涂層板（右）。b，液氮冷處理12小時(shí)后VNP菌株的存活率（n=5）。冷凍休克處理前后應(yīng)變活性變化示意圖（右）。c，使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察不同細(xì)胞的形態(tài)。紅色箭頭表示細(xì)胞內(nèi)菌株。比例尺=5μm（正常視野）和1μm（放大視野）。d，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Live MACS/VNP-RFP和LNT MACS/VNP-RFP細(xì)胞培養(yǎng)板的RFP熒光強(qiáng)度變化（n=3）。e，使用VNP-pSifB-RFP（紅色熒光蛋白，RFP）通過(guò)MACS檢查細(xì)菌釋放的示意圖（左）。由于pSifB啟動(dòng)子，VNP-pSifB-RFP菌株僅在細(xì)胞內(nèi)被激活并表達(dá)RFP。MACS或LB培養(yǎng)基中VNP-psifB-RFP菌株的熒光場(chǎng)圖片（右）。激活的VNP-psifB-RFP菌株（紅色）；沙門氏菌特異性抗體標(biāo)記VNP（綠色）；DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。比例尺=5μm。f，從LNT MACS/VNP-pSifB-RFP細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)VNP-pSifB-RFP菌株的明場(chǎng)圖片（左）。赫斯特標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。橙色箭頭表示細(xì)胞內(nèi)菌株，紅色箭頭表示細(xì)胞外菌株。將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有痕量慶大霉素的培養(yǎng)基中。比例尺=20μm。從三個(gè)液氮處理時(shí)間組（處理后6/12/24小時(shí)）的不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選擇5個(gè)視野來(lái)計(jì)數(shù)胞外表達(dá)RFP的細(xì)菌（右）。g，借助TEM觀察LNT MACS/VNP細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)VNP菌株的釋放（左）。白色曲線顯示應(yīng)變從細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的運(yùn)動(dòng)。橙色箭頭表示LNT MACS細(xì)胞表面的凹口，這可能是由細(xì)胞內(nèi)應(yīng)變運(yùn)動(dòng)引起的。藍(lán)色箭頭表示細(xì)胞外增殖的細(xì)菌。比例尺=1μm（正常視野）和500 nm（放大視野）。細(xì)胞內(nèi)應(yīng)變釋放示意圖（右）。h，正常VNP和LNT MACS釋放的VNP在37°C LB液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌形態(tài)（頂部）和生長(zhǎng)曲線（底部）（n=3）。i使用3.0μm Transwell小室間接共培養(yǎng)LNT MACS/VNP細(xì)胞與H22腫瘤細(xì)胞的示意圖。細(xì)菌可以穿過(guò)這種孔徑的室。j(i)中H22腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間后的相對(duì)平均熒光強(qiáng)度(MFI)比較。k H22細(xì)胞以100 MOI的不同VNP感染1小時(shí)，并通過(guò)將細(xì)胞裂解物鋪在LB固體板上來(lái)確定內(nèi)化VNP的數(shù)量(n=5)。l H22細(xì)胞與不同菌株以MOI為100孵育4小時(shí)后，對(duì)Annexin V和碘化丙啶（PI）染色進(jìn)行代表性FACS分析，凋亡細(xì)胞（Annexin V+細(xì)胞）百分比的定量分析顯示在右邊（n=4）。m不同菌株與M0型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)后，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)抗腫瘤M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平。n與LNT VNP、LNT MACS或LNT MACS/VNP孵育或不孵育后H22腫瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞核染料Hoechst用于檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量的變化。
圖3、LNT MACS保護(hù)VNP菌株免遭清除并促進(jìn)其在腫瘤中的積累。a LNT MACS/VNP細(xì)胞偽裝胞內(nèi)菌株以逃避中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)菌清除的示意圖。b原代腹膜中性粒細(xì)胞與LNT MACS+VNP和LNT MACS/VNP共培養(yǎng)不同時(shí)間后培養(yǎng)基中活菌株百分比的變化。c、d比較（b）中不同處理后60分鐘培養(yǎng)基中中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NET和ROS水平。e不同處理后1小時(shí)外周血中性粒細(xì)胞總數(shù)中活化中性粒細(xì)胞（CD11b高CD62L低）百分比變化的代表性流式細(xì)胞圖（上）和條形比較圖（下）（n=5）。f通過(guò)共聚焦顯微鏡分析Live MACS、Live MACS/VNP和LNT MACS/VNP細(xì)胞中的CD11b和CCR2表達(dá)。白色箭頭表示細(xì)胞內(nèi)菌株。比例尺=10μm。g不同細(xì)胞中CD11b和CCR2的代表性流式細(xì)胞術(shù)。h顯示指定組腫瘤的熒光和生物發(fā)光強(qiáng)度（n=5）。使用DiR標(biāo)記的細(xì)胞和VNP-LuxCDABE菌株。i(h)中不同處理后8小時(shí)分離的腫瘤的熒光圖像。j注射后時(shí)間與腫瘤內(nèi)細(xì)菌數(shù)量之間的關(guān)系（n=4或5）。k根據(jù)第6天提取的器官回收的CFU計(jì)算每克細(xì)菌CFU的腫瘤與肝臟比率(n=5)
圖4、LNT MACS/VNP可降低菌株誘導(dǎo)的生物毒性。a H22荷瘤小鼠不同組別(G0-G4)的安全性評(píng)估、腫瘤靶向和治療試驗(yàn)示意圖。b給藥1天后各組小鼠肝臟炎癥病變的代表性圖片。黑色箭頭表示病理性肝臟病變的部位。比例尺=10毫米。c(b)中各組肝臟炎癥病變點(diǎn)數(shù)比較的條形圖（n=5）。d代表性H&E染色的特寫視圖，顯示治療后1天的肝損傷（黑色箭頭）。比例尺=40μm。e隨機(jī)選擇(d)中的5個(gè)視野來(lái)計(jì)算病變面積。f不同治療后1天的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平（n=4或5）。g不同治療后1天體重變化（n=9或18）。h細(xì)菌刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的示意圖。i不同治療后1天（n=5或6）H22荷瘤小鼠外周血中IL-6（上）和IL-10（下）濃度的檢測(cè)。j不同治療后1天外周血CD4+T細(xì)胞中Tregs（CD25+CD127 Low細(xì)胞）百分比的變化。顯示了代表性的流式細(xì)胞術(shù)圖（n=5）。k心臟、腎、肺和脾切片代表性H&E染色的特寫視圖（比例尺=40μm）。
圖5、LNT MACS/VNP細(xì)胞有效抑制H22腫瘤生長(zhǎng)。a H22荷瘤小鼠不同組別(G0-G4)的安全性評(píng)估、腫瘤靶向和治療試驗(yàn)示意圖。b不同治療后的腫瘤生長(zhǎng)情況（n=7）。c(b)中每只小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。(b)中給藥后12天對(duì)腫瘤進(jìn)行拍照(d)并稱重(e)。比例尺=10毫米。f(b)中不同組腫瘤體積倍增時(shí)間的比較。g腫瘤的代表性H&E染色圖像（左），隨機(jī)選擇5個(gè)視野來(lái)計(jì)算壞死區(qū)域的面積（右）。黑色箭頭表示壞死區(qū)域。比例尺=100μm。h按(a)中所述處理的小鼠的存活曲線。當(dāng)小鼠達(dá)到人道終點(diǎn)時(shí)，它們被殺死。
總結(jié)
本研究開發(fā)了一種新型的腫瘤靶向治療方法，通過(guò)冷凍休克巨噬細(xì)胞來(lái)偽裝減毒沙門氏菌，用于癌癥的免疫治療。由于細(xì)菌治療的安全性和有效性難以平衡，限制了其在臨床應(yīng)用的推廣。本研究通過(guò)液氮冷凍休克處理含有減毒沙門氏菌VNP20009的巨噬細(xì)胞株，制備出“死亡”但“功能性”的沙門氏菌加載巨噬細(xì)胞。這些處理后的巨噬細(xì)胞保持了完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，失去了原有的致病性，而內(nèi)部的細(xì)菌保留了原有的生物活性，并能在體內(nèi)延遲釋放和增殖。這種“特洛伊木馬”策略有效避免了細(xì)菌免疫原性引起的中性粒細(xì)胞招募和激活，減少了細(xì)菌被中性粒細(xì)胞清除，增強(qiáng)了細(xì)菌在腫瘤中的富集效率。Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同條件下細(xì)菌（如減毒沙門氏菌VNP20009及其變體）在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，通過(guò)Bioscreen C收集的數(shù)據(jù)，研究者能夠比較正常培養(yǎng)條件下的VNP細(xì)菌和從冷凍休克巨噬細(xì)胞中釋放的VNP細(xì)菌的生長(zhǎng)特性，包括生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的時(shí)間，并確定最佳的細(xì)菌培養(yǎng)條件，如溫度、pH值和培養(yǎng)基成分，以確保細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性和活性。幫助研究者詳細(xì)分析了細(xì)菌的生長(zhǎng)特性，這對(duì)于評(píng)估冷凍休克巨噬細(xì)胞偽裝減毒沙門氏菌策略的有效性至關(guān)重要。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，研究者能夠優(yōu)化治療方案，并為進(jìn)一步的體內(nèi)外研究提供了重要的基礎(chǔ)信息。此外這種策略還激活了腫瘤微環(huán)境，提高了抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞（包括M1型巨噬細(xì)胞和CD8+Teffs）的數(shù)量，減少了促腫瘤效應(yīng)細(xì)胞（包括M2型巨噬細(xì)胞和CD4+Tregs）的數(shù)量，并最終在皮下H22荷瘤小鼠模型中提高了抗腫瘤效果。液氮冷凍休克巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)菌輸送策略有望擴(kuò)展活菌治療癌癥的治療應(yīng)用。
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