生物膜形成和定量。 使用先前描述的方法在聚苯乙烯表面測定所有菌株的生物膜形成。為了便于定量和顯微鏡檢查，使用96孔和24孔聚苯乙烯微孔板培養(yǎng)生物膜。通過將5μl過夜培養(yǎng)物的懸浮細(xì)胞接種到96孔微孔板單個孔中的300 ul SDM培養(yǎng)基中，或?qū)?5μl細(xì)胞懸浮液接種到24孔板中2 ml SDM培養(yǎng)基中來啟動生物膜的生長。然后將微孔板在37°C、5% CO?條件下靜置培養(yǎng)16小時。孵育后，移除液體培養(yǎng)基，并用無菌蒸餾水沖洗孔一次。將板（96孔）風(fēng)干，并用0.1% 的沙黃染色10分鐘。染色后，用蒸餾水沖洗板以去除多余的染料，并風(fēng)干3小時。通過使用酶聯(lián)免疫吸附測定微孔板讀數(shù)器（型號3550；Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.）測量染色生物膜在490 nm處的吸光度來定量生物膜。每個測定進行三次重復(fù)，無生物膜的孔在沙黃染色后用作空白對照。在24孔板中形成的生物膜在去除浮游細(xì)胞后、染色前立即拍照。
粘附測定。 測定菌株粘附到粘蛋白包被的聚苯乙烯表面的能力，以確定單個基因失活對初始粘附的影響。聚苯乙烯微孔板的表面首先用2 ml 1% 的豬胃粘蛋白（III型；Sigma）在粘附緩沖液（10 mM KPO?, 50 mM KCl, 1 mM CaCl?, 0.1 mM MgCl?, pH 7.0）中預(yù)處理。將板在室溫下輕輕搖動孵育2小時，移除多余的粘蛋白溶液后風(fēng)干。然后通過加入2 ml預(yù)先制備的靜息細(xì)胞懸浮液（密度為10? 細(xì)胞/ml）開始粘附。靜息細(xì)胞通過離心過夜培養(yǎng)物制備，洗滌兩次，并重懸于粘附緩沖液中。將板在37°C下輕輕搖動孵育2小時。孵育后，移除未粘附的細(xì)胞，并通過輕微超聲處理將粘附細(xì)胞解離到2 ml緩沖液中。對粘附和非粘附細(xì)胞進行活菌落計數(shù)以確定粘附細(xì)胞的百分比。
酸耐受性測定。 首先通過評估在pH 5.0和7.0的THYE瓊脂平板上的生長來評估pH對hk11和rr11缺失突變體的影響。將突變體和親本菌株在THYE肉湯（pH 7.0）中過夜培養(yǎng)。將一份過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到九份新鮮培養(yǎng)基中，并在37°C、5% CO?氣氛中繼續(xù)培養(yǎng)2小時。在用于10 mM KPO?緩沖液（pH 7.2）進行系列稀釋之前，將培養(yǎng)物輕輕超聲處理15秒以分散細(xì)胞鏈。將每種菌株的細(xì)胞懸浮液等分試樣（20μl）接種到pH 5.0和pH 7.0的THYE瓊脂平板上。然后將板在37°C、5% CO?氣氛中孵育40小時，然后評估酸敏感性。通過在pH 5.0的THYE平板上培養(yǎng)40小時后比較親本和突變體的生長來確定對低pH的敏感性。
還在肉湯中培養(yǎng)菌株，通過先前描述的方法測定可誘導(dǎo)的ATR。所有ATR實驗在補充了20 mM葡萄糖的TYE培養(yǎng)基（使用40 mM磷酸-檸檬酸鹽緩沖液制備，pH分別為7.5、5.5和3.5）中進行。簡而言之，通過將1體積過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到9體積（1:10）新鮮TYEG（pH 7.5）中，并在37°C、5% CO?氣氛中培養(yǎng)2小時來制備對數(shù)中期細(xì)胞。這些細(xì)胞通過在10,000 x g下離心10分鐘收集，并重懸于2 ml新鮮TYEG（pH 5.5）中，濁度為0.6（A600）。通過在37°C、5% CO?條件下孵育2小時來誘導(dǎo)細(xì)胞進行酸適應(yīng)。然后將適應(yīng)的對數(shù)期細(xì)胞暴露于預(yù)確定的致死pH 3.5（通過將未適應(yīng)的對數(shù)中期細(xì)胞在pH值從6.0到2.0的TYEG中培養(yǎng)3小時來確定）。立即從每個樣品中取一份細(xì)胞懸浮液以確定零時的總活細(xì)胞數(shù)，并將培養(yǎng)物在37°C、5% CO?條件下孵育3小時。孵育后，取一份細(xì)胞懸浮液通過活菌計數(shù)確定存活百分比。ATR表示為在致死pH下存活3小時的細(xì)胞百分比。
酸適應(yīng)期間細(xì)胞的1?C標(biāo)記。 通過將細(xì)胞暴露于1?C標(biāo)記的氨基酸，然后進行蛋白質(zhì)提取和二維凝膠電泳分離，來評估NG8和SMHK11在酸適應(yīng)過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。將NG8和SMHK11的三個獨立培養(yǎng)物在由六種氨基酸（谷氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸和天冬酰胺）、40 mM磷酸-檸檬酸鹽緩沖液（pH 7.5）和20 mM葡萄糖組成的最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長中期（600 nm處光密度= 0.7），在不含葡萄糖和緩沖液的培養(yǎng)基中洗滌兩次，并重懸于2.5 ml新鮮最小培養(yǎng)基中，濃度為2 x 10? 細(xì)胞/ml。將每個菌株的三份培養(yǎng)物分成兩部分，一部分暴露于pH 5.5，另一部分保持在pH 7.5，并存在150μCi的1?C-氨基酸混合物。在37°C下孵育30分鐘，通過向每個管中加入2 mg氯霉素停止蛋白質(zhì)合成。離心細(xì)胞（15,000 xg，10分鐘）并洗滌（使用10 mM Tris-HCl, pH 6.8，含1 mM EDTA和5 mM MgSO?）。將細(xì)胞儲存在-20°C，并使用超聲處理（在玻璃珠存在下）制備用于二維凝膠電泳的細(xì)胞蛋白提取物，如先前所述。
二維凝膠電泳和蛋白質(zhì)圖譜圖像分析。 二維凝膠電泳和放射自顯影圖像分析采用先前描述的方法進行。第一維等電聚焦在線性pH 4至7的18厘米固定化pH梯度凝膠條上進行，上樣量為10? cpm，對應(yīng)于150μg細(xì)胞蛋白。第二維分離使用14%聚丙烯酰胺梯度凝膠（185 x 200 x 1.0 mm）進行，干燥的凝膠暴露于X射線膠片14天。放射自顯影上可視化的蛋白質(zhì)使用Bio Image軟件（版本6.1）在Sun Sparc工作站上進行分析。如果酸暴露細(xì)胞（pH 5.5）與對照細(xì)胞（pH 7.5）相比，相對積分光強度變化超過兩倍，則將該蛋白質(zhì)點分類為差異表達(dá)。進行了三次獨立實驗；對每個點計算了變異系數(shù)；那些表現(xiàn)出高固有表達(dá)變異的蛋白質(zhì)被排除為酸應(yīng)激蛋白。
顯微鏡檢查。 為了通過掃描電子顯微鏡檢查生物膜的空間分布和結(jié)構(gòu)，將聚苯乙烯微孔板表面形成的生物膜用10 mM磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次，通過加入2 ml 3.7%甲醛（溶于10 mM磷酸鹽緩沖鹽水）固定，并在室溫下孵育24小時。然后通過一系列乙醇沖洗（30%、50%、70%、95%和100%）對樣品進行脫水，并用液態(tài)CO?進行臨界點干燥。將孔底表面切下，安裝并進行金濺射鍍膜。然后使用掃描電子顯微鏡（型號S-2500；Hitachi Instruments, San Jose, Calif.）檢查樣品。
我們之前觀察到，變形鏈球菌中由comC基因編碼的CSP激活了一個未表征的第二途徑，該途徑似乎與細(xì)胞分離或鏈形成有關(guān)。由CSP激活的第二途徑仍有待確定。為了測試由hk/rr11編碼的TCSTS是否可能是第二途徑，我們通過光學(xué)顯微鏡比較了在添加或不添加CSP的情況下，hk/rr11突變體在生物膜中形成的鏈長度。簡而言之，使用先前描述的方法在微孔板中培養(yǎng)突變體生物膜，不同之處在于每個孔含有一個滅菌的蓋玻片作為底物，并且培養(yǎng)物補充了1.0μg/ml新鮮CSP。生物膜在SDM培養(yǎng)基中生長16小時，然后移除液體。然后將生物膜用0.1%結(jié)晶紫染色1分鐘，然后放在顯微鏡載玻片上。然后通過光學(xué)顯微鏡（Olympus CH30RF100; Tokyo, Japan）觀察生物膜并定性評估細(xì)胞鏈長度。
相關(guān)新聞推薦
1、全自動微生物生長曲線分析儀監(jiān)測碳青霉烯酶突變體在不同條件下的生長速率
3、豬鏈球菌2型生長曲線繪制、毒力因子基因鑒定及小鼠致病性試驗（一）