近日，蘭州大學(xué)環(huán)境微生物課題組聯(lián)合上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院以及斯坦福大學(xué)在環(huán)境領(lǐng)域TOP期刊Environmental Science&Technology上發(fā)表了題目為“Novel Feruloyl Esterase for the Degradation of Polyethylene Terephthalate(PET)Screened from the Gut Microbiome of Plastic-Degrading Mealworms(Tenebrio Molitor Larvae)”的文章。第一作者為2023屆博士畢業(yè)生吐爾遜阿依（現(xiàn)就職于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院），通訊作者為韓華雯青年研究員和李祥鍇教授。
聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最常用的合成聚合物之一，在日常生活中發(fā)揮著不可或缺的作用。全球每年生產(chǎn)近7000萬噸PET塑料，廣泛應(yīng)用于紡織品、包裝和容器的制作。PET是一種石油衍生品，由乙二醇（EG）和對苯二甲酸乙酯（TPA）組成，其高度耐微生物或酶降解。與其它處理方法相比，微生物降解塑料由于成本低、環(huán)保等優(yōu)點，成為了塑料處理領(lǐng)域中最具前景的替代方案。典型PET降解細菌主要是從分離自塑料污染的環(huán)境，如Ideonella sakaiensis和Pseudomonas aestusnigri，其可分泌PET水解酶IsPETase和PE-H。然而，這些野生型PET降解酶的環(huán)境適應(yīng)性差，且活性較低，限制了大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。大多數(shù)PET降解酶主要篩選自塑料污染富集的生境（如垃圾填埋場、活性污泥及海洋環(huán)境），其發(fā)掘過程主要以報道的IsPETase和枝葉堆肥角質(zhì)酶LCC作為參比序列，從而將PET降解酶“篩選池”限定在較窄的序列空間。鑒于此，采用創(chuàng)新的篩選策略深入探索未知生態(tài)位，有助于發(fā)掘并鑒定出新型塑料降解酶。
昆蟲的食性選擇經(jīng)歷漫長的過程，其腸道微生物短時間內(nèi)無法進化出塑料降解酶。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，以玉米秸稈(CS)和聚苯乙烯(PS)為食的黃粉蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)相似。作為有機聚合物，木質(zhì)纖維素和塑料在多個維度展現(xiàn)出相似性，包括疏水性、結(jié)晶度和化學(xué)鍵等方面。塑料中主要的化學(xué)鍵包括C-C鍵（例如，在PE，PP和PVC的主鏈中）和酯鍵(例如，在PET中)。木質(zhì)素是一種高度非均相的芳香族聚合物，通過酯鍵與半纖維素和纖維素鏈接形成復(fù)雜的木質(zhì)纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。值得注意的是：水解酶家族蛋白展現(xiàn)出了對木質(zhì)纖維素及含有酯鍵塑料（如PET與聚乳酸PLA）的非凡活性。因此，我們假設(shè)黃粉蟲幼蟲腸道微生物中參與木質(zhì)纖維素降解的酶可能具備降解PET的能力。為了驗證這一假說，本研究聚焦于黃粉蟲幼蟲腸道微生物中與木質(zhì)纖維素降解密切相關(guān)的基因序列，篩選出兼具阿魏酸活性的新型PET降解酶TmFae-PETase。
本研究提供了一種新的篩選PET降解酶的策略，為從木質(zhì)素降解相關(guān)環(huán)境中發(fā)掘新型塑料降解酶奠定了基礎(chǔ)，從而拓寬了現(xiàn)有的塑料降解酶庫，將推動其在塑料污染治理中的應(yīng)用潛力。
1.從木質(zhì)纖維素降解酶中篩選PET降解酶
屬于CAZy家族的大多數(shù)蛋白具有木質(zhì)纖維素降解能力。根據(jù)黃粉蟲幼蟲腸道微生物宏基因組基因注釋，共有808個基因被歸類為CEs類，具體來說，CE1和CE10家族的豐度最高，總共包含428個基因（圖1a-b）。研究人員通過一系列篩選標(biāo)準，包括氨基酸序列相似性低于85%、氨基酸序列長度超過200個氨基酸，以及完整的開放閱讀框（ORF）序列，最終篩選出22個候選基因。通過構(gòu)建這些基因與已知纖維素降解酶的系統(tǒng)發(fā)育樹，研究人員隨機選擇了5個來自不同分支的候選基因進行后續(xù)研究（圖1c-e）?；蚓幪柡髢晌粸?5和96的蛋白是不溶性蛋白，其他三個蛋白分別是07、74和55為可溶性蛋白。（圖1f）。三丁酸甘油酯平板水解圈實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白07和74并未有明顯的水解圈，而蛋白55則顯示出與已報道的酶LCC一致的水解圈（圖1e）。其次，三種蛋白（07，74，55）對PET塑料的降解能力測試結(jié)果顯示，只有蛋白55出現(xiàn)與PET降解產(chǎn)物MHET和TPA標(biāo)準品一致的峰，且產(chǎn)生的MHET和TPA的峰面積隨時間而增高（圖1h-i）。SEM結(jié)果顯示，經(jīng)蛋白55處理后的PET膜表面出現(xiàn)了明顯的點蝕和氣孔（圖1j,k）。此外，F(xiàn)TIR結(jié)果進一步表明，與未處理的PET塑料相比，經(jīng)蛋白55處理的PET的代表疏水性基團（R-OH:3200-3800 cm-1）和C=O鍵（1500-2000 cm-1）發(fā)生了變化（圖1l）。這說明酶處理后的PET疏水性變?nèi)?，且C=O鍵被酶破壞。以上實驗結(jié)果均證明蛋白55具有PET塑料降解功能。
圖1.黃粉蟲腸道微生物群中PET降解酶的生物信息學(xué)篩選。黃粉蟲幼蟲。(a)黃粉蟲腸道微生物宏基因組中碳水化合物活性酶(CAZymes)主要類別的比例；(b)CE家族的相對豐度；(c)候選酶的篩選標(biāo)準；(d)22個基因和已知木質(zhì)纖維素降解酶的系統(tǒng)發(fā)育樹；(e)5個選定候選酶的生物信息；(f)蛋白SDS-PAEG凝膠電泳圖；(g)在三丁酸甘油酯瓊脂板上酶周圍形成的水解圈；(h,i)PET降解產(chǎn)物MHET和TPA的HPLC色譜圖；(j,k)未處理(CK)和酶55處理PET薄膜的SEM圖；(l)未處理和酶55處理PET薄膜的FT-IR光譜圖。
2.TmFae-PETase阿魏酸酯酶活性以及CS降解能力
PDB庫比對結(jié)果顯示，蛋白55在結(jié)構(gòu)上與阿魏酸酯酶LP_0796展現(xiàn)出了最高的相似性（相似性為48%），因此將編號為55的蛋白命名為TmFae-PETase。TmFae-PETase與gf-PET在30°C下孵育10天后，共產(chǎn)生97.8μM的PET降解產(chǎn)物MHET和TPA(圖2a,d)。TmFae-PETase的阿魏酸酯酶活性測試結(jié)果表明TmFae-PETase可以水解阿魏酸甲酯（MFA）和咖啡酸甲酯（MCA），并隨著反應(yīng)時間的推移，水解產(chǎn)物阿魏酸（FA）和咖啡酸（CA）的濃度增加（圖2b,c）。TmFae-PETase對MCA的降解速度比MFA快，反應(yīng)2h后CA的產(chǎn)生量高于FA或其他時間段，而隨著時間的推移，F(xiàn)A的釋放量越來越高（圖2e,f）。GC-MS結(jié)果顯示，經(jīng)酶處理的CS中出現(xiàn)了9-十八烯酸(Z)-甲酯（C19H36O2），而未處理組CS沒有出現(xiàn)該產(chǎn)物（圖2h）。先前的研究報道，長鏈脂肪酸如9-十八烯酸是木質(zhì)纖維素的降解中間產(chǎn)物。此外，F(xiàn)TIR結(jié)果進一步顯示，酶處理組和未處理組CS樣品的光譜出現(xiàn)顯著差異。在3400 cm?1處出現(xiàn)了強的吸收峰，這代表木質(zhì)素中芳香族和脂肪族R-OH的拉伸振動（圖3i）。
圖2.PET降解酶TmFae-PETase的表征。(a?c)TmFae-PETase在PET、MFA和MCA水解過程中釋放產(chǎn)物的HPLC譜圖;(d?f)TmFae-PETase的PET、MFA和MCA水解活性;(g)TmFae-PETase對PET和MFA底物的偏好測試;(h)TmFae-PETase處理CS降解產(chǎn)物的GC-MS色譜圖;(i)TmFae-PETase處理和未處理的CS樣品的FT-IR光譜。注:CS=玉米秸稈。
新篩選PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳條件、實際應(yīng)用（一）
新篩選PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳條件、實際應(yīng)用（二）
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