研究簡(jiǎn)介
本研究揭示了結(jié)核分枝桿菌（Mtb）通過(guò)代謝產(chǎn)物亞油酸（linoleic acid）調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，促進(jìn)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的機(jī)制。研究表明，在低氧條件下，Mtb通過(guò)其ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)v1272c表達(dá)增加，促進(jìn)卵磷脂的攝取和亞油酸的產(chǎn)生與釋放。亞油酸被感染巨噬細(xì)胞釋放后，通過(guò)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）上的免疫檢查點(diǎn)分子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS），從而促進(jìn)Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。研究使用了全基因組敲除（KO）突變體庫(kù)篩選，發(fā)現(xiàn)Rv1272c基因?qū)tb在體內(nèi)的存活至關(guān)重要。進(jìn)一步的代謝組學(xué)分析表明，Rv1272c缺失顯著降低了Mtb感染的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDMs）培養(yǎng)上清中亞油酸的水平。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，外源性亞油酸補(bǔ)充可以恢復(fù)因Rv1272c缺失而受損的Mtb在體內(nèi)的存活能力。機(jī)制上，亞油酸通過(guò)與Tregs細(xì)胞內(nèi)的ATP2a3結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）與線粒體的膜形成，加速ER向線粒體的鈣離子（Ca2?）轉(zhuǎn)移，耗盡ER中的Ca2?，并觸發(fā)鈣離子儲(chǔ)存操作性進(jìn)入（SOCE），從而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2?水平，進(jìn)而促進(jìn)依賴Ca2?的CTLA-4在Tregs表面的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)阻斷CTLA-4可以顯著降低Mtb在小鼠肺部的負(fù)載，并減輕病理?yè)p傷，顯示出潛在的治療效果。本研究不僅揭示了Mtb如何利用代謝產(chǎn)物操縱宿主免疫系統(tǒng)以增強(qiáng)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力，還為開(kāi)發(fā)針對(duì)結(jié)核病的新療法提供了可能的靶點(diǎn)，特別是在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CTLA-4的作用方面。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)改進(jìn)現(xiàn)有結(jié)核病治療策略具有重要意義。
Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C生長(zhǎng)曲線分析儀在研究中被用于監(jiān)測(cè)不同結(jié)核分枝桿菌菌株的體外生長(zhǎng)情況。首先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD600nm≈0.6）的各菌株制備成菌懸液。將調(diào)整至相似密度的菌懸液（約200μl）加入Bioscreen C專(zhuān)用的100孔蜂窩板中。Bioscreen C生長(zhǎng)曲線分析在37°C下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)兩周。本研究使用Bioscreen C來(lái)比較野生型H37Rv、Rv1272c敲除株（H37RvΔRv1272c）和回補(bǔ)株（H37Rv(ΔRv1272c+Rv1272c)）在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
研究發(fā)現(xiàn)Mtb并非被動(dòng)適應(yīng)宿主環(huán)境，而是通過(guò)其代謝產(chǎn)物亞油酸主動(dòng)操縱宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，特別是Treg細(xì)胞的功能。Mtb的基因Rv1272c被全基因組CRISPR敲除篩選鑒定為體內(nèi)存活所必需。該基因在缺氧條件下表達(dá)增加，負(fù)責(zé)卵磷脂的攝取，并導(dǎo)致亞油酸水平升高。亞油酸與ATP2a3的結(jié)合促進(jìn)了線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）的形成，從而加速了鈣離子（Ca2?）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的轉(zhuǎn)移。這導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)耗竭，進(jìn)而觸發(fā)儲(chǔ)存操縱性鈣內(nèi)流（SOCE），使得胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）通過(guò)其基因Rv1272c調(diào)控宿主免疫反應(yīng)，促進(jìn)自身在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存。在缺氧條件下，Mtb上調(diào)Rv1272c（一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的表達(dá)，進(jìn)而增加卵磷脂的攝取，并生成和釋放亞油酸。巨噬細(xì)胞釋放的亞油酸通過(guò)作用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg cells）上的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP2a3，促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)分子CTLA-4向Treg細(xì)胞表面的運(yùn)輸。CTLA-4的增加會(huì)抑制巨噬細(xì)胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而削弱其殺菌能力，最終促進(jìn)Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。
圖1、Rv1272c通過(guò)亞油酸促進(jìn)分枝桿菌在體內(nèi)的存活。a，在小鼠中篩選的Mtb生存必需基因的火山圖。藍(lán)點(diǎn)表示此時(shí)間點(diǎn)對(duì)Mtb體內(nèi)存活至關(guān)重要的基因。b-f，C57BL/6小鼠被氣溶膠感染，每只小鼠感染了~200個(gè)指定Mtb菌株的菌落形成單位（c.f.u.）。小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖如b所示。感染4周后，使用抗酸染色（C;比例尺，100μm（上）和20μm（下））、細(xì)菌c.f.u.（d）、H&E染色（比例尺，1 mm;每個(gè)部分的量化炎癥區(qū)域值）（E）和量化炎癥區(qū)域（F）對(duì)感染小鼠的肺切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析。
g）熱圖顯示Mtb感染的BMDM培養(yǎng)上清液中部分代謝物差異24小時(shí)。h，i）C57BL/6小鼠被氣溶膠感染，每只小鼠的指定Mtb菌株的~200 c.f.u.。在4 wpi下分析肺勻漿上清液（h）和血清（i）中的亞油酸（LA）濃度。（j，k）測(cè)定用或不用卵磷脂（100μM）處理14天的Mtb裂解（j）或培養(yǎng)上清液（k）的亞油酸濃度。（l，m）將Mtb菌株與卵磷脂（100μM）一起孵育或不與卵磷脂（100μM）孵育14 d后，測(cè)定Mtb感染的BMDM細(xì)胞裂解（l）和培養(yǎng)上清液（m）中亞油酸的濃度24 h。（n-p）C57BL/6小鼠用氣溶膠感染了每只指定Mtb菌株的小鼠~200 c.f.u.，并用或不用亞油酸處理。感染4周后，采用H&E染色（比例尺，1 mm，每切片量化炎癥面積值）（n）和定量炎癥區(qū)域（o）對(duì)感染小鼠肺切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析，并定量細(xì)菌c.f.u.（p）。
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