1.3.3 PCR產(chǎn)物的回收
拿出擴(kuò)增結(jié)束Ep管，從中取出5L反應(yīng)產(chǎn)物，加入1L上樣緩沖液，再加入4L的ddH2O混勻。點(diǎn)入預(yù)先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中，120V電泳。在紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。切膠到1.5mL的EP管中，稱重(不超過200mg)，加入600L QG，50℃水浴10min，(如果未完全溶解，要繼續(xù)水浴，直至完全溶解)，每2～3min鐘漩渦混勻一次。將溶液轉(zhuǎn)到吸附柱上，12000rmp 1min。倒廢液，向吸附柱中加入300 LQG，12000 rmp 1min。倒廢液，加入700LPE，室溫放置2～5min,12000rmp 1min。倒廢液，加入500LPE，室溫放置2-5min,12000rmp 1min。倒廢液，空柱子12000rmp 2min。將吸附柱轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，靜置5min揮發(fā)殘留的PE。向膜中央加入10L的EB，靜置3min，12000rmp 2min，扔掉吸附柱，EP管中即為凝膠回收產(chǎn)物。
1.3.4 DNA片段測(cè)序
將回收的片段送至生物公司測(cè)序，測(cè)序引物為16S rDNA通用引物。
1.4砷氧化菌株的生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè)：
1.4.1菌株在砷脅迫和無砷脅迫中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
分別以1%接種量至TSB培養(yǎng)基和1m mol/L As(III)的TSB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(37℃，200r/min)，每隔2h取樣，用紫外分光光度計(jì)在OD600測(cè)其吸光值。以時(shí)間t(h)為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線圖。
1.4.2菌株對(duì)砷的耐受性
在斜面上用接種針取一環(huán)菌種至5mL TSB培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng)12h(200r/min，30℃)。取下將菌液搖勻，以1%接種量分別接種于含As(III)的TSB試管培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)。砷濃度分別是0、1、10、30、35、40、45、50、55、60、65 m mol/L，培養(yǎng)20h，菌株的菌密度值用分光光度計(jì)OD600測(cè)定。
1.4.3菌株對(duì)重金屬銅的耐受性
在斜面上用接種針取一環(huán)菌種至5mL TSB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)12h(200r/min，30℃)。取下將菌液搖勻，以1%接種量分別接種于含Cu2+的TSB試管培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)。砷濃度分別是0、0.2、0.4、0.7、1.0m mol/L，培養(yǎng)20h，菌株的菌密度值用分光光度計(jì)OD600測(cè)定。
2結(jié)果與分析
2.1篩選砷耐受菌及其砷氧化能力的鑒定：
分離得到并命名為11號(hào)菌株對(duì)砷氧化能力明顯。在含1mM As(Ⅲ)的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)11號(hào)菌，12h后取培養(yǎng)液上清與AgNO3溶液反應(yīng)，并與As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度溶液于AgNO3溶液反應(yīng)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)11號(hào)菌株在培養(yǎng)12h后其上清液與AgNO3溶液發(fā)生反應(yīng)后顏色同As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度溶液100/0接近，可推斷出該菌株氧化能力接近100%.
2.2砷氧化菌株16S rRNA基因測(cè)序鑒定菌種：
2.2.1 PCR擴(kuò)增電泳分析
圖1泳道1～4為PCR產(chǎn)物，M道為標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量MARKER
由圖2可以看出，16S rRNA大小為1.5KB左右，圖中1～4道電泳條帶單一，分子量符合，可以進(jìn)行下一步測(cè)序。
2.2.2菌株16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果：
2.2.3構(gòu)建進(jìn)化樹：
圖2根據(jù)11號(hào)菌16srRNA測(cè)序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹
根據(jù)上述結(jié)果初步確定11號(hào)菌屬于假單胞菌屬(pseudomonas)，而已有假單胞菌屬被發(fā)現(xiàn)有對(duì)砷的氧化還原代謝能力。
2.3在砷脅迫下菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定：
圖4可以看出，菌株8 h達(dá)到生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，12～28h達(dá)到生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。砷的加入并不改變菌體的生長(zhǎng)規(guī)律，而在砷脅迫下砷對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。
2.4菌株對(duì)砷的耐受性分析：
含砷量越高，砷對(duì)菌的生長(zhǎng)抑制越大。當(dāng)水中As(Ⅲ)達(dá)65mM/L時(shí)，菌的生長(zhǎng)出現(xiàn)了停止，說明菌株對(duì)As(Ⅲ)的耐受量為65mM/L.
2.5菌株對(duì)銅的耐受性分析：
含銅離子濃度越高，其對(duì)菌的生長(zhǎng)抑制越大。當(dāng)水中Cu2+達(dá)1mM/L時(shí)，菌的生長(zhǎng)出現(xiàn)了停止，說明菌株對(duì)Cu2+的耐受量1mM/L.
圖5菌株對(duì)銅的耐受性
3展望
對(duì)微生物砷代謝機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，微生物的砷甲基化和微生物對(duì)砷的氧化作用都可以將As(Ⅲ)轉(zhuǎn)化為毒性較低的有機(jī)砷或As(Ⅴ)。如何利用微生物對(duì)砷污染環(huán)境進(jìn)行修復(fù)已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)，因此生物修復(fù)被認(rèn)為是修復(fù)砷污染環(huán)境的重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)的這株砷氧化菌，能在As(Ⅲ)環(huán)境下氧化As(Ⅲ)為As(Ⅴ)，降低環(huán)境中的毒性，同時(shí)完成自身的生長(zhǎng)。對(duì)As(Ⅲ)的耐受量為65mM/L，相較已報(bào)道的CLL-B7[10]，其耐受性達(dá)到CLL-B7的1.5倍，有很高的研究?jī)r(jià)值。后續(xù)將針對(duì)其砷環(huán)境脅迫中的相關(guān)基因表達(dá)及重要代謝循環(huán)的過程變化研究其對(duì)砷的氧化代謝機(jī)制。
砷氧化菌株在砷脅迫中生長(zhǎng)曲線測(cè)定及重金屬銅的耐受性（一）
砷氧化菌株在砷脅迫中生長(zhǎng)曲線測(cè)定及重金屬銅的耐受性（二）
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