3.2.抗生素對生物膜的影響
兩性霉素B是用于真菌感染的標(biāo)準(zhǔn)抗生素，但其腎毒性是該治療最嚴(yán)重的問題。此外，其通過膜的滲透性差是增加患者給藥劑量的原因，這有助于真菌耐藥性的發(fā)展。像先前研究一樣，我們的結(jié)果（圖3）證實(shí)兩性霉素B促進(jìn)預(yù)形成生物膜的進(jìn)一步生長而不是根除它，但能夠抑制微生物粘附約60%與對照相比，在濃度3μg ml?1下，這是近平滑念珠菌懸浮細(xì)胞MIC的兩倍。另一方面，兩性霉素B能夠減少克魯斯念珠菌固著細(xì)胞預(yù)形成生物膜的定植區(qū)域，即使在濃度5μg ml?1下（其懸浮細(xì)胞MIC的兩倍）。其抑制微生物粘附的效果在最高測試濃度（20μg ml?1）下僅為35%。兩性霉素B對任一研究微生物的生物膜發(fā)展無顯著影響，且不影響生物膜排列（圖像未顯示）。
3.3.天然物質(zhì)對生物膜的影響
雖然黃芩素對念珠菌屬懸浮細(xì)胞的抗真菌活性以及對白念珠菌的抗生物膜活性先前已被報(bào)道，并且黃芩素對近平滑念珠菌懸浮細(xì)胞的影響已被研究，但關(guān)于黃芩素對近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌抗生物膜活性的數(shù)據(jù)仍然不足。
為了提供黃芩素抗生物膜活性的更詳細(xì)評估，圖4顯示黃芩素對三個不同階段生物膜形成的影響。發(fā)現(xiàn)黃芩素對每種研究念珠菌菌株的效率不同。在近平滑念珠菌中觀察到預(yù)形成生物膜生物量的更高減少，不影響生物膜排列。在近平滑念珠菌中即使在20μg ml?1下觀察到約60%預(yù)形成生物膜抑制，在克魯斯念珠菌中在50μg ml?1下（單因素方差分析，P≤0.001）。在近平滑念珠菌中觀察到黃芩素對生物膜排列和簇形成的影響（圖4中白圈高亮簇）。黃芩素抑制近平滑念珠菌生物膜發(fā)展（單因素方差分析，P=0.005），但未確認(rèn)對克魯斯念珠菌的顯著影響（單因素方差分析，P=0.074）。在濃度低于MIC——近平滑念珠菌50μg ml?1和克魯斯念珠菌細(xì)胞60μg ml?1下觀察到超過30%微生物粘附抑制，結(jié)果顯著性通過單因素方差分析對兩種微生物確認(rèn)（P<0.001）。黃芩素在所有研究實(shí)驗(yàn)設(shè)置（粘附、生物膜發(fā)展和預(yù)形成生物膜）中誘導(dǎo)克魯斯念珠菌生物膜簇形成，在近平滑念珠菌中較高濃度下。
殼聚糖的抗菌作用以及低分子量殼聚糖水凝膠的抗真菌和抗生物膜特性先前已被描述。殼聚糖似乎是微生物粘附抑制或生物膜減少的非常有效的劑。已證明殼聚糖水凝膠能夠顯著減少體外和體內(nèi)念珠菌生物膜形成。盡管生物膜結(jié)構(gòu)存在巨大差異，不僅在不同物種菌株之間，而且在同一物種菌株之間，殼聚糖活性在同一物種內(nèi)通常一致和恒定。
使用新方法——通過Cellavista自動顯微鏡評估隨后圖像分析，我們確認(rèn)了近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌的這一結(jié)果（圖5）并補(bǔ)充了描述殼聚糖對生物膜形成影響的數(shù)據(jù)。與先前研究相反，我們的結(jié)果顯示了殼聚糖對近平滑念珠菌微生物粘附抑制的顯著抑制效果（單因素方差分析，P<0.001）在顯著更低濃度下（在40μg ml?1下粘附減少60%）特別是克魯斯念珠菌（在20μg ml?1下下降80%，通過單因素方差分析確認(rèn)，P<0.001）。在物質(zhì)自然影響生物膜發(fā)展的條件下，殼聚糖對近平滑念珠菌無影響；殼聚糖甚至增加克魯斯念珠菌在此生物膜生長階段的生物膜形成。殼聚糖對近平滑念珠菌的根除作用，僅影響預(yù)形成生物膜根除中的固著細(xì)胞，最大為30%（在40μg ml?1下），而克魯斯念珠菌預(yù)形成生物膜根除約為40%（在25μg ml?1下）。殼聚糖對近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌生物膜根除的影響顯著（單因素方差分析，P=0.015）。
Cellavista基本上是一種允許將單個圖像合并為更大單元的自動顯微鏡。如此創(chuàng)建的較大區(qū)域組合隨后進(jìn)行圖像分析。根據(jù)已發(fā)表作品，該設(shè)備通常用于組織培養(yǎng)監(jiān)測和分析，但其特性也可有利地用于微生物生物膜研究，生物膜通常在載體上創(chuàng)建異質(zhì)形成，單個顯微鏡圖像不提供完全客觀的視圖。據(jù)我們所知，Cellavista從未用于酵母細(xì)胞粘附定量或研究通過添加抗生素和其他具有抗生物膜活性的生物活性天然物質(zhì)誘導(dǎo)的生物膜形成不同階段的調(diào)節(jié)效應(yīng)。唯一相關(guān)研究描述了使用Cellavista通過熒光應(yīng)用藻類生物膜對表面的污染。
使用Cellavista自動顯微鏡與圖像分析軟件為固著細(xì)胞的定性和定量帶來了新的可能性，并同時將生物膜特征化為整體。在我們的研究中，這一特性通過探索兩性霉素B、黃芩素和殼聚糖對酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性通過明場應(yīng)用記錄。對于熒光應(yīng)用，需要40x物鏡，因此培養(yǎng)容器底部厚度不應(yīng)厚于約150-200微米。這需要專用培養(yǎng)容器，理想情況下具有指定用于顯微鏡的玻璃底部，厚度均勻。對于高通量篩選，我們因此提出明場應(yīng)用和本工作中使用的標(biāo)準(zhǔn)微孔板。我們的方法將其應(yīng)用潛力擴(kuò)展到微生物領(lǐng)域，并允許輕松監(jiān)測生物膜形成和快速篩選生物活性化合物的效果。
總之，我們已顯示黃芩素和殼聚糖是能夠抑制微生物對表面粘附或破壞近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌預(yù)形成生物膜的天然物質(zhì)。另一方面，通常使用的真菌抗生素兩性霉素B促進(jìn)近平滑念珠菌生物膜形成而不是根除它。自動顯微鏡Cellavista因此代表一種顯著提高實(shí)驗(yàn)工作效率的優(yōu)秀設(shè)備，提供與先前發(fā)布程序完全可比的結(jié)果，并如上所述允許更全面的生物膜視圖。
雖然黃芩素在高濃度下顯示抗菌活性，但其抗生物膜活性在約低十倍的濃度下觀察到。這是一個相當(dāng)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)先前描述的物質(zhì)通常在更高濃度下對生物膜更有效而不是對懸浮細(xì)胞的最小抑制濃度。我們相信黃芩素和殼聚糖適用于醫(yī)療設(shè)備上微生物生物膜的破壞，并且也可以預(yù)期以合適的應(yīng)用形式適用于各種人類生物膜相關(guān)感染的治療。
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