耐藥性克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細菌作為人類感染的重要病原，是臨床治療重要的挑戰(zhàn)。本研究對多株克雷伯氏菌裂解性噬菌體的生物學(xué)特性和基因組特征進行比較分析，為其應(yīng)用提供更多科學(xué)數(shù)據(jù)。
【方法】使用雙層平板法從人類和動物新鮮糞便、污水中分離純化裂解性克雷伯氏菌噬菌體；通過磷鎢酸染色和透射電鏡觀察其形態(tài)；采用雙層平板噬菌斑法確定其宿主范圍，測定溫度和pH穩(wěn)定性、一步生長曲線和體外抑菌效果等生物學(xué)特性；基于全基因組測序?qū)Ψ蛛x株進行比較基因組學(xué)分析；通過體內(nèi)抑菌試驗評估噬菌體對多重耐藥變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola) BS375-3感染的大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲的保護作用。
1、材料與方法
1.1菌株來源分離
噬菌體所用宿主菌(1株K.variicola和3株K.pneumoniae)樣品均采集自唐山市某醫(yī)院，均由本實驗室分離并置于–20℃甘油水凍存保藏。菌株信息NMDCX0000171存儲在國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心(National Data Center for Microbial Sciences,NMDC)。
1.2噬菌體分離純化
樣本采集自唐山市某醫(yī)院人類糞便、養(yǎng)豬場糞便和廣州市西朗污水處理廠。對于糞便樣品，將2 g置于15 mL離心管，補加無菌水至10 mL，充分混勻制成懸濁液，污水樣品則取10 mL直接進行下步操作。樣品8 000 r/min離心10 min，將上清液通過0.22μm水系微孔濾膜過濾至新的離心管內(nèi)。將5 mL MH(B)培養(yǎng)基、1 mL上清濾液和100μL過夜培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)物在另一15 mL離心管中混勻，35℃條件150 r/min連續(xù)培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)液再次離心，上清液過濾后4℃保存?zhèn)溆?。?00μL宿主菌液與8 mL預(yù)熱的半固體培養(yǎng)基[40–50℃，MH(B)培養(yǎng)基+0.7%瓊脂]混勻，傾倒于底層固體MH(A)平板，滴加10μL濾液，待液體干燥后倒置于35℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)12 h，期間多次觀察是否有透明噬菌斑出現(xiàn)。使用雙層平板法對噬菌體進行純化，挑取雙層平板表面出現(xiàn)的單個噬菌斑，10倍梯度連續(xù)稀釋，吸取適宜稀釋度下100μL噬菌體液與等體積宿主菌液混勻，35℃條件下吸附10 min，加入8 mL預(yù)熱的半固體培養(yǎng)基，顛倒混勻后倒入MH(A)平板，冷卻凝固后35℃條件下倒置培養(yǎng)12 h。以上步驟重復(fù)3–5次，至噬菌斑形態(tài)、大小均一不再變化，即獲得單一噬菌體。上述操作均在無菌條件下進行。
1.3一步生長曲線
將噬菌體與宿主菌以0.01的比例混合，于35 ℃孵育10 min吸附噬菌體。10 000 r/min離心1 min收集細菌，棄去上清，用新鮮MH(B)洗滌2次，之后重懸沉淀并添加MH(B)至5 mL，將離心管振蕩混勻，計為0時刻，間隔10 min取樣并經(jīng)10 000 r/min離心1 min，取上層清液通過雙層平板法測定效價，繪制一步生長曲線。
1.4體外抑菌實驗
將對數(shù)生長期的菌株培養(yǎng)物，用MH(B)稀釋，調(diào)OD595值為0.15，將稀釋后的菌株培養(yǎng)物分裝至4只無菌離心管內(nèi)，每管10 mL，設(shè)置4個組，1個對照和3個實驗組(表1)。對照組，離心管加入等體積MH(B)培養(yǎng)基；實驗組1 [感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=10]，10 mL菌株培養(yǎng)物加入等體積噬菌體液(以MOI為10的比例)；實驗組2 (MOI=1)，10 mL菌株培養(yǎng)物加入等體積噬菌體液(以MOI為1的比例)；實驗組3 (MOI=0.1)，10 mL菌株培養(yǎng)物加入等體積噬菌體液(以MOI為0.1的比例)。每組充分混勻后，分別分裝至1.5 mL離心管，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，每3 h取樣并測定595 nm處的吸光度，連續(xù)測定24 h，每組重復(fù)3次，繪制噬菌體體外抑菌曲線。
1.5噬菌體對大蠟螟幼蟲的體內(nèi)抑菌效果
重新復(fù)蘇多重耐藥變棲克雷伯氏菌BS375-3，進行活菌計數(shù)并調(diào)整其菌量為2×104、2×105、2×106 CFU。將體重為200–250 mg的大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲隨機分為3組，每組10只，饑餓處理24 h。使用70%的酒精對大蠟螟幼蟲進行體表消毒，自尾部第一左足處注射K. variicola BS375-3菌液(20 μL/只，2×104、2×105、2×106 CFU)，置于37 ℃黑暗培養(yǎng)箱，禁食處理，每隔4 h記錄存活率，連續(xù)記錄96 h。2×105 CFU感染的大蠟螟幼蟲在96 h內(nèi)死亡率為70%，被用于正式試驗的感染菌量。將體重為200–250 mg的大蠟螟幼蟲隨機分為6組，每組10只，禁食處理24 h，使用70%醫(yī)用酒精進行體表消毒。對于空白對照組及噬菌體處理組，首先自尾部第一左足處注射20 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)，30 min后自對側(cè)足部分別注射等量PBS和噬菌體pKV-BS375-3.1 (2×107 PFU)；對于其余試驗組，首先自尾部第一左足處注射20 μL K.variicola BS375-3菌液20 μL (2×105 CFU)，30 min后在對側(cè)足部分別注射等量的PBS、pKV-BS375-3.1 (2×107、2×106、2×105 PFU，表2)。將幼蟲置于37 °C黑暗環(huán)境培養(yǎng)箱中，禁食處理，每隔4 h記錄存活率，連續(xù)記錄96 h。觀察黑化情況和存活率。
2、結(jié)果
2.1噬菌體一步生長曲線
噬菌體一步生長曲線的測定發(fā)現(xiàn)，噬菌體pKP-BM327-1.2和pKP-M186-2.1潛伏期最長 (20 min)，噬菌體pKP-BM327-1.2在第70分鐘結(jié)束裂解期進入平臺期，而噬菌體pKP-M186-2.1裂解期持續(xù)60 min進入平臺期。噬菌體pKP-M186-2.2潛伏期小于10 min，在第60分鐘進入平臺期。噬菌體pKP-BS317-1.1潛伏期為10 min，在80 min時進入平臺期；噬菌體pKV-BS375-3.1潛伏期小于10 min，該噬菌體在50 min時進入平臺期。
圖1 噬菌體的生物學(xué)特性
圖2 噬菌體體外抑菌試驗
2.2噬菌體體外抑菌效果
以未加噬菌體的細菌培養(yǎng)物作為對照，通過24 h內(nèi)測定OD595評估5株噬菌體不同MOI (10、1、0.1)的體外抑菌效果。K. pneumoniae BM327-1培養(yǎng)物OD595在12 h內(nèi)持續(xù)增加，以MOI為10的比例加入噬菌體pKP-BM327-1.2顯示出最好的抑菌效果，3 h內(nèi)完全抑制宿主菌株的生長(圖2A)；具有同一宿主菌(K. pneumoniae M186-2) 的噬菌體pKP-M186-2.1和pKP-M186-2.2表現(xiàn)出不同的體外抑菌效果：噬菌體pKP-M186-2.1可持續(xù)抑菌3 h，且與感染復(fù)數(shù)未表現(xiàn)出相關(guān)性(圖2B)，而以MOI為10的比例加入噬菌體pKP-M186-2.2后可以在6 h內(nèi)完全抑制細菌增殖，以MOI為1和0.1添加噬菌體時，前3 h曲線呈上升趨勢(圖2C)，表明低劑量的噬菌體pKP-M186-2.2抑菌效果較差；噬菌體pKP-BS317-1.1和pKV-BS375-3.1具有相似的體外抑菌效果，2株噬菌體均可持續(xù)抑制細菌達6 h (圖2D、2E)。雖然5株噬菌體具有多樣化的體外抑菌效果，但由于噬菌體抗性突變菌株的出現(xiàn)及增殖，體外抑菌曲線均會在3 h或6 h后呈現(xiàn)上升趨勢。
2.3 噬菌體對大蠟螟幼蟲的體內(nèi)抑菌效果
圖3 噬菌體pKV-BS375-3.1對感染Klebsiella variicola BS375-3大蠟螟幼蟲的保護效果
基于體外抑菌效果，選擇噬菌體pKV-BS375-3.1進行大蠟螟幼蟲體內(nèi)抑菌試驗?？瞻讓φ蘸褪删w處理組未發(fā)現(xiàn)大蠟螟幼蟲的黑化和死亡(圖3A、3B)。大蠟螟幼蟲感染組，在感染30 min后分別注射PBS和不同MOI比例的噬菌體。與空白對照組相比，感染但未經(jīng)噬菌體處理組的大蠟螟幼蟲在96 h內(nèi)全部黑化，死亡率為90% (圖3C)。感染后經(jīng)MOI為100、10、1噬菌體處理組的大蠟螟幼蟲96 h內(nèi)死亡率分別為20%、60%和60% (圖3D–3F)。Kaplan-Meier分析顯示，感染后噬菌體處理組(MOI為100)大蠟螟幼蟲96 h內(nèi)存活率極顯著高于感染對照組(K. variicola BS375-3+PBS)大蠟螟幼蟲(P<0.001)。感染后噬菌體處理組(MOI為10和1)的大蠟螟幼蟲在96 h內(nèi)存活率均為40%，但與感染對照組(K. variicola BS375-3+PBS)不存在顯著差異(P>0.05，圖3G)。
結(jié)論
本研究中，不同噬菌體表現(xiàn)出不同的體外抑菌效果。整體來說，噬菌體在前3–6 h抑菌效果最好，隨后出現(xiàn)噬菌體抗性菌。先前的研究表明，肺炎克雷伯氏菌噬菌體P24在1 h內(nèi)裂解殺死108 CFU/mL宿主菌，并持續(xù)抑制細菌生長4 h ，與之相比，本研究中所分離噬菌體具有更長的抑菌時間。噬菌體抗性菌的出現(xiàn)是噬菌體療法的重要挑戰(zhàn)，但噬菌體抗性可能會導(dǎo)致細菌對抗生素耐藥性的喪失。研究表明，K. pneumoniae 77與噬菌體KP36作用后，約半數(shù)突變株(14/31)的質(zhì)粒丟失blaCTX-M、ant(3’’)、sul2、folA、mph(E)/mph(G)基因，從而恢復(fù)對抗生素的敏感性。另一研究發(fā)現(xiàn)，對萬古霉素和達托霉素耐藥的糞腸球菌由于Epa (胞外多糖生物合成基因)的突變而產(chǎn)生了對噬菌體的抗性，但對細胞壁和細胞膜靶向抗生素重新敏感。不僅如此，噬菌體抗性的出現(xiàn)還會導(dǎo)致細菌毒力的降低，例如，單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)被證明獲得噬菌體抗性后磷壁酸糖基化基因發(fā)生突變，這導(dǎo)致其在小鼠體內(nèi)模型中毒力減弱，以及對Caco-2上皮細胞和HepG2肝細胞細胞系的入侵缺陷。因此，噬菌體雞尾酒療法或噬菌體與抗生素聯(lián)合治療對于預(yù)防和抑制噬菌體抗性菌的出現(xiàn)具有良好前景。
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