土壤病毒是土壤生物多樣性的重要組成部分，數(shù)量繁多，在調(diào)控微生物多樣性、群落組成和養(yǎng)分循環(huán)等方面具有重要的生態(tài)功能。然而，由于土壤自身的復(fù)雜性及其動(dòng)態(tài)變化特征，病毒在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的功能及其作用機(jī)理，一直是該研究領(lǐng)域的薄弱環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前土壤生物學(xué)、微生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿。下面一起來了解下土壤病毒研究常用方法有哪些。
大多數(shù)土壤病毒研究的第一步工作是需要將吸附在土壤顆粒上的病毒粒子進(jìn)行洗脫浸提，而10%的檸檬酸鉀溶液、10%的牛肉膏、250 mmol/L的甘氨酸溶液和10 mmol/L的焦磷酸鈉溶液為最常用的4種土壤病毒洗脫浸提液，其中對于農(nóng)田土壤病毒洗脫提取，10%的檸檬酸鉀溶液效果相對最佳。
通過比較了3種物理分散方法(振蕩、渦旋和超聲處理)和10種土壤病毒洗脫浸提液，最終確定了從(亞)熱帶紅壤中提取病毒的優(yōu)化方法。此外，為得到高濃度的土壤病毒提取液，還需要對其進(jìn)行土壤病毒純化及富集。目前最常用的土壤病毒純化及富集方法是聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法、CsCl平衡梯度等密度離心法及切向流過濾法(tangential-flow filtration,TFF)。其中，對于土壤病毒粒子的分離、純化及富集主要采用切向流過濾法，其原理是利用蠕動(dòng)泵將土壤病毒洗脫液勻速流經(jīng)特定孔徑的過濾膜，從而實(shí)現(xiàn)土壤病毒提取液的純化及濃縮。
表1土壤典型病毒
在獲取純化及富集后的土壤病毒粒子，可依靠掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)和流式細(xì)胞儀(flow cytometer,FC)等工具，對其進(jìn)行計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性分析，此外，當(dāng)前宏病毒組技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于土壤病毒研究，屬于研究熱點(diǎn)之一。值得注意的是，由于病毒基因組不同于原核微生物基因組，沒有類似于原核生物16S rRNA基因普遍保守的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，因此難以利用分子生物技術(shù)對土壤病毒多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行綜合分析。
當(dāng)前唯有在特定病毒類群中，才可利用某些高度保守的標(biāo)記基因評(píng)估某個(gè)類群中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(如g23)，但攜帶類似保守基因的病毒只占自然環(huán)境中所有病毒種群的極小比例，不能夠完整地反映環(huán)境中病毒多樣性特征。隨著高通量測序和宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們無須通過宿主培養(yǎng)及單基因標(biāo)記，僅通過對整個(gè)環(huán)境中的病毒基因進(jìn)行比較分析就可以研究病毒多樣性。宏病毒組主要有兩種分析方法，一是直接收集土壤中的病毒，提取DNA并測序分析。
然而，實(shí)驗(yàn)收集的過程會(huì)造成一定程度的病毒損失，且由于土壤病毒基因組含量少，需要通過全基因組擴(kuò)增病毒基因組以達(dá)到可測序濃度，會(huì)出現(xiàn)偏好性擴(kuò)增，這些因素都影響著宏基因組序列信息對土壤病毒多樣性的真實(shí)反映；二是從細(xì)菌宏基因組中挖掘病毒序列信息。然而，由于細(xì)菌基因組的干擾以及土壤病毒基因庫的不完整性，導(dǎo)致土壤病毒的大量序列無法有效注釋。由于這些技術(shù)方面的限制，目前通過宏病毒組研究土壤病毒多樣性的報(bào)道較少。
此外，也有研究利用病毒指紋圖譜技術(shù)來探究土壤病毒多樣性，如利用RAPD-PCR(random PCR amplification of polymorphic DNA)技術(shù)發(fā)現(xiàn)南極不同地點(diǎn)土壤病毒群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，且病毒群落結(jié)構(gòu)隨環(huán)境變化而異。
相關(guān)新聞推薦
1、實(shí)驗(yàn)證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長性及產(chǎn)毒（一）
2、兩種常規(guī)蒸餾方法獲取的百里香、迷迭香精油及水餾液分子含量的變化（二）
3、微生物菌懸液的制備及用酶標(biāo)儀分光光度法繪制菌株生長曲線