芳樟醇(3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇)，別名里那醇，是一種無(wú)色或淺黃色、易揮發(fā)的液體，存在于多種植物精油中。芳樟醇具有較高的安全性，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.148—2015將芳樟醇列入食品添加劑，美國(guó)食品和藥物管理局將芳樟醇?xì)w類為“公認(rèn)安全使用物質(zhì)”(GRAS)。芳樟醇可用作天然食用香料，也可用于配制食用香精，在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中常用作增香劑和調(diào)味劑；同時(shí)，芳樟醇具有良好的抗菌活性。研究表明，芳樟醇對(duì)銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌]和大腸桿菌等細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)白色念珠菌、皮膚癬菌等真菌也具有抑菌活性，氣相的芳樟醇對(duì)大腸桿菌也具有較強(qiáng)的氣相抗菌活性。研究認(rèn)為，芳樟醇在活性食品包裝中具有應(yīng)用前景，可通過(guò)微膠囊化、制備抗菌膜等方式釋放其抗菌活性，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。目前，芳樟醇的抑菌機(jī)制尚不明確，有關(guān)芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。
本研究擬以莓實(shí)假單胞菌為指標(biāo)菌，探討芳樟醇對(duì)其抑菌活性及作用機(jī)制。通過(guò)測(cè)定芳樟醇的最小抑菌濃度(MIC)，判斷其抑菌作用強(qiáng)弱；采用紫外分光光度法測(cè)定指標(biāo)菌的生長(zhǎng)曲線，評(píng)價(jià)芳樟醇的抑菌活性；通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察、結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)、二乙酸熒光素(FDA)染色實(shí)驗(yàn)以及測(cè)定電導(dǎo)率、核酸泄漏、呼吸代謝活力和呼吸鏈脫氫酶活性的變化，考察芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用和呼吸代謝的抑制作用，探究芳樟醇對(duì)指標(biāo)菌的抑菌機(jī)制，希望為其應(yīng)用于食品保鮮和開(kāi)發(fā)天然防腐劑提供理論依據(jù)。
莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)曲線的繪制
采用紫外分光光度法測(cè)定莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。按1.3.1方法制備菌懸液，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；以加入濃度為1倍MIC(1MIC)和2倍MIC(2MIC)的芳樟醇為實(shí)驗(yàn)組，按1.3.2方法設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣，并測(cè)定600 nm處的吸光值(OD600)，連續(xù)24 h。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，所測(cè)吸光值為縱坐標(biāo)，繪制莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。
芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響
細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線可以直觀反映其生長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)速率。為研究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響，在研究抑菌活性的基礎(chǔ)上，測(cè)定了莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1。由圖1可知，空白組和陰性對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)均呈典型的S型生長(zhǎng)曲線，空白組經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的延滯期后，OD值顯著增高，進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；陰性對(duì)照組生長(zhǎng)略微緩慢于空白組，最終與空白組同時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，表明1%的乙醇有一定的抑菌作用，但對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響不大。含有1MIC和2MIC芳樟醇的實(shí)驗(yàn)組，生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)顯著差異，OD值基本處于低值波動(dòng)，數(shù)值和增長(zhǎng)幅度明顯低于空白組和陰性對(duì)照組，說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)較為緩慢。結(jié)果表明，芳樟醇延緩了莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，能有效抑制莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)。
圖1莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線
本文研究了芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及作用機(jī)制，結(jié)果表明：芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用，其最小抑菌濃度為1.5 mL/L；芳樟醇能破壞莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜的完整性，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)向外泄漏；芳樟醇抑制呼吸鏈脫氫酶活性，破壞呼吸鏈，引起細(xì)胞呼吸代謝活力降低，從而導(dǎo)致胞內(nèi)代謝紊亂，抑制菌體生長(zhǎng)。
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