生物膜測定
為確定在LB培養(yǎng)基中形成生物膜的能力，將細(xì)菌在補充有4 mM CaCl2和4 mM MgCl2的LB肉湯中于室溫培養(yǎng)18小時，并在相同培養(yǎng)基中稀釋至A600nm 0.02。為確定在TMH-gal+或TMH-gal+arg培養(yǎng)基中形成生物膜的能力，將細(xì)菌在僅補充0.2%半乳糖的TMH中于室溫培養(yǎng)18小時。然后將這些培養(yǎng)物首先在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中1:10稀釋，隨后在TMH-gal+或TMH-gal+arg培養(yǎng)基中1:400稀釋。取100μl等分試樣加入96孔聚苯乙烯板的孔中，并在環(huán)境室溫下以250 rpm振蕩培養(yǎng)48小時。用蒸餾水洗滌孔三次以去除培養(yǎng)基和浮游細(xì)胞，然后用200μl的0.05%藏紅染色附著生物膜20分鐘。用蒸餾水洗滌孔三次，將板干燥48小時。用200μl的30%乙酸溶解結(jié)合的藏紅染料30分鐘，并立即測量A450nm。測定使用3-4次獨立的生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)三個技術(shù)重復(fù)進(jìn)行。
鼠疫耶爾森菌誘變和互補
使用pKOBEG方法創(chuàng)建鼠疫耶爾森菌ΔrovM突變株，其中整個靶基因被來自pUC4K的Tn703卡那霉素盒替換。使用引物對lxmarovMf/lxbarovMr和rxbarovMf/rhindrovMr通過PCR從鼠疫耶爾森菌KIM6+基因組DNA中產(chǎn)生rovM基因的左右側(cè)翼區(qū)域。將這兩個PCR片段分別克隆到pUC19的Xmai/XbaI和XbaI/HindIII位點。使用引物kanxbaf和kanxbar擴(kuò)增卡那霉素盒，并將其克隆到含有rovM側(cè)翼區(qū)域的pUC19質(zhì)粒的XbaI位點。將新質(zhì)粒pUC19rovM500flanking用作模板，使用引物lxmarovMf和rhindrovMr生成線性PCR片段，用于pKOBEG方法進(jìn)行誘變。通過DNA測序驗證突變。ArovM::kan突變體在此簡稱為ArovM。使用引物lxmarovMf和rhindrovMr從鼠疫耶爾森菌KIM6+基因組DNA生成包含rovM基因和天然啟動子區(qū)域的片段，并將該片段克隆到高拷貝數(shù)質(zhì)粒TOPO-pCR2.1（pCR_rovM）中。然后，通過用BamHI和XhoI消化pCR_rovM質(zhì)粒分離包含rovM基因和天然啟動子區(qū)域的片段，并將其克隆到低拷貝數(shù)質(zhì)粒pACYC177（pACrovM）的相應(yīng)位點上。通過DNA測序驗證構(gòu)建體。通過電穿孔分別用pACrovM或pCR_rovM轉(zhuǎn)化ArovM突變體，以實現(xiàn)rovM突變的反式互補。用空pACYC177質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鼠疫耶爾森菌ArovM突變體和野生型菌株，并用pCR_rovM構(gòu)建體轉(zhuǎn)化野生型菌株用于比較rovM過表達(dá)實驗。除非另有說明，所有后續(xù)實驗均使用攜帶質(zhì)粒的菌株進(jìn)行。本研究中使用的所有菌株和引物列于表1。
跳蚤感染
用于跳蚤感染的鼠疫耶爾森菌KIM6+（pACYC177）、△rovM突變體（pACYC177）和△rovM（pACrovM）菌株在腦心浸液（BHI）肉湯中連續(xù)培養(yǎng)兩次，首先在28°C，然后在37°C不通氣培養(yǎng)。離心細(xì)菌培養(yǎng)物，將細(xì)菌沉淀重懸于0.5 ml PBS中，并加入5 ml新鮮肝素化小鼠血液，濃度約為1X109個細(xì)胞/mL。然后讓Xenopsylla cheopis跳蚤使用先前描述的人工飼喂室以受感染血液為食。攝取血餐的跳蚤在21°C和75%相對濕度下維持，每周兩次以未感染小鼠為食，并在28天內(nèi)監(jiān)測前胃阻塞情況。通過在感染性血餐后立即、感染后7天和28天采集的20只受感染跳蚤樣本中的細(xì)菌負(fù)荷（cfu計數(shù)）確定感染率。
共感染與單一感染類似地進(jìn)行。讓跳蚤以含有大約1:1比例的ΔrovM突變體或ΔrovM（pACrovM）與野生型菌株的血液為食。在感染后0天和28天，通過僅在耶爾森菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)（YSAB-irg）上補充1μg/μL異噻唑啉（irgasan）進(jìn)行鋪板，確定16-20只受感染跳蚤的細(xì)菌負(fù)荷，以確定每只跳蚤的總鼠疫耶爾森菌cfu。同時，在YSAB-irg上添加50μg/mL卡那霉素或100μg/mL羧芐青霉素進(jìn)行鋪板，以分別選擇ΔrovM突變體或ΔrovM（pACrovM）。進(jìn)行了兩次獨立的共感染測定。
RT-qPCR
使用RNeasy RNA分離試劑盒從三個獨立的指數(shù)期培養(yǎng)物和跳蚤中分離RNA，并用rDnase I處理以去除污染的基因組DNA。對于從跳蚤中分離RNA，在處理感染后兩周，處理約35個跳蚤腸道的三個獨立重復(fù)池，如先前所述。使用Agilent Bioanalyzer 2100評估RNA質(zhì)量，僅使用RIN值≥8且A260/A280比值約為2.0的樣品。通過RNA的實時PCR確認(rèn)樣品無基因組DNA污染。按照制造商的說明，使用Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶從2-5μgs總RNA合成cDNA。每個25μL定量PCR反應(yīng)使用每樣品20ngs cDNA，重復(fù)三次，使用Taqman Universal PCR Master Mix在ABI Prism 7900序列檢測系統(tǒng)上使用以下條件進(jìn)行：95°C 10分鐘，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95°C 15秒和60°C 1分鐘。使用Primer Express version 2.0軟件設(shè)計Taqman引物和探針組，列于表1。
所有三個基因的引物和探針組的最終使用濃度分別為500nM和250nM。對于每個引物-探針組測定，使用已知濃度的鼠疫耶爾森菌KIM6+基因組DNA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線用于將CT值轉(zhuǎn)換為相對DNA量。每個實驗基因的cDNA量相對于參考基因crr（y1485）的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，該基因的表達(dá)不受體內(nèi)或體外生長條件的影響。S1數(shù)據(jù)集包含使用SMM培養(yǎng)基條件的RT-qPCR原始數(shù)據(jù)，之前尚未使用crr標(biāo)準(zhǔn)化對照基因進(jìn)行RT-qPCR。每個測定對三個獨立的生物學(xué)樣品進(jìn)行三次重復(fù)。為了計算倍數(shù)變化，我們使用兩個菌株之間（感興趣基因/crr）的標(biāo)準(zhǔn)化值的比率，例如，菌株A和菌株B之間感興趣基因轉(zhuǎn)錄本的倍數(shù)變化將通過從（感興趣基因/crr）菌株A/（感興趣基因/crr）菌株B得出比率來計算。
統(tǒng)計分析
使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析（One Way ANOVA）和Tukey多重比較事后檢驗來確定生物膜形成、生長速率和轉(zhuǎn)錄水平的任何顯著差異。對于跳蚤共感染測定，使用學(xué)生t檢驗來確定感染后第0天和第28天每個菌株的平均感染百分比之間的顯著差異。對指數(shù)生長期進(jìn)行線性回歸分析以確定每個菌株的生長速率（μ）。
相關(guān)新聞推薦
1、細(xì)菌生長效率、細(xì)菌生產(chǎn)力、細(xì)菌呼吸率研究方法一覽
2、微生物實驗室不同等級的區(qū)別，微生物檢驗流程、方法及發(fā)展趨勢
3、不同鋅濃度下菌株Ⅳ8R3、Ⅱ2R3的生長曲線及玉米生長和鋅積累的影響（二）