摘要
洋蔥伯克霍爾德菌及伯克霍爾德菌復(fù)合體（BCC）的其他成員是高度多重耐藥的細(xì)菌，可引起囊性纖維化患者的嚴(yán)重肺部感染。對2686種來源于海洋生物的化合物進行篩選，鑒定出能與多粘菌素B（PMB）協(xié)同抑制洋蔥伯克霍爾德菌生長的分子。在1μg/mL濃度下，五種化合物與PMB協(xié)同作用，使洋蔥伯克霍爾德菌的生長抑制≥70%，相比單獨使用PMB。后續(xù)測試顯示，篩選中的一種化合物，氨基香豆素抗生素新生霉素，與PMB和粘菌素協(xié)同作用，對抗妥布霉素耐藥的臨床分離株洋蔥伯克霍爾德菌和多重伯克霍爾德菌。同時，我們發(fā)現(xiàn)新生霉素敏感性在BCC物種中常見，且這些細(xì)菌對另一種氨基香豆素氯新生霉素更敏感，后者與PMB對洋蔥伯克霍爾德菌也具有相加效應(yīng)。這些研究支持使用氨基香豆素抗生素治療BCC感染，并表明可以找到協(xié)同劑來增強抗微生物肽和多粘菌素對BCC細(xì)菌的效力。
1.引言
多重耐藥性的驚人增加，特別是內(nèi)在的高水平耐藥性，削弱了改善慢性病患者健康和延長壽命的新治療方法。例如，囊性纖維化（CF）患者慢性肺部細(xì)菌感染導(dǎo)致的呼吸衰竭阻礙了過去幾十年生存率的提高，并且仍然是主要死因。內(nèi)在多重耐藥的CF病原體不斷出現(xiàn)，如伯克霍爾德菌復(fù)合體（BCC）細(xì)菌、嗜麥芽窄食單胞菌、木糖氧化無色桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，這迫切需求新療法。多重耐藥細(xì)菌數(shù)量的增長，以及缺乏新抗生素來對抗它們，導(dǎo)致多粘菌素（一類脂聯(lián)抗微生物肽（AMPs））的復(fù)興，作為最后手段的治療，盡管先前報道了其全身毒性。不幸的是，BCC細(xì)菌也對這類化合物耐藥。我們研究了治療策略，以破壞BCC的高水平內(nèi)在多重耐藥性，使用洋蔥伯克霍爾德菌作為模型細(xì)菌。洋蔥伯克霍爾德菌是一種環(huán)境機會病原體，屬于BCC，可引起CF患者的嚴(yán)重呼吸道感染。這些感染與肺功能更快下降、debilitating exacerbations和最終死亡相關(guān)，并且它們還降低了CF患者肺移植后的生存率。
抗微生物佐劑是抑制細(xì)菌抗生素耐藥機制的分子，有效增加細(xì)菌對該抗生素的敏感性。這一概念已被研究作為逆轉(zhuǎn)細(xì)菌抗生素耐藥性的有吸引力的方法。在這里，我們使用一種策略，通過篩選來源于海洋的天然分子庫，鑒定與多粘菌素B（PMB）協(xié)同對抗洋蔥伯克霍爾德菌的化合物。這些協(xié)同劑降低了洋蔥伯克霍爾德菌和其他BCC細(xì)菌對PMB和粘菌素（多粘菌素E）的極端耐藥性，從而提高了它們的抗微生物有效性。臨床上，這可以提供一種有效的方法來減少多粘菌素的劑量，從而提高其療效，同時克服其毒性作用。
2.材料和方法
2.1.細(xì)菌菌株
洋蔥伯克霍爾德菌K56-2用于初始篩選；該分離株來自CF患者，是洋蔥伯克霍爾德菌ET-12流行克隆譜系的常用原型菌株。后續(xù)研究使用先前描述的BCC菌株組以及兩株妥布霉素耐藥的洋蔥伯克霍爾德菌CF分離株（GIB-C1141144和GRI-C1210932）。
2.2.篩選化合物庫以尋找與多粘菌素B的協(xié)同作用
該庫包含2686種來源于海洋生物的化合物，由Biomar Microbial Technologies（萊昂，西班牙）分離和表征。這些化合物的溶液被接種到一對100孔Bioscreen C板（Growth Curves USA,Piscataway,NJ）中，溶劑被蒸發(fā)。洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的過夜培養(yǎng)物在新鮮LB肉湯（Becton Dickinson&Co.,Franklin Lakes,NJ）中稀釋至600nm光密度（OD600）為0.0002，并加入板中（300μL/孔），溶解化合物至最終濃度1μg/mL。板對在Bioscreen C自動生長曲線分析儀（Oy Growth Curves AB Ltd.,Helsinki,Finland）中于37°C連續(xù)中等振蕩培養(yǎng)。
2小時后，PMB以最終濃度500μg/mL加入一個板中，而PMB溶解的載體對照（0.2%牛血清白蛋白和0.01%乙酸）加入另一個板中。該PMB濃度對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的生長影響很?。〝?shù)據(jù)未顯示）。每對板中也包含無化合物的孔。板進一步在37°C孵育，每30分鐘讀取OD600。此外，每板有一個孔無化合物，接收無菌LB加載體對照或PMB，作為陰性對照，并確認(rèn)每個實驗在無菌條件下進行。該實驗設(shè)計允許鑒定對洋蔥伯克霍爾德菌有直接抗微生物活性的化合物以及與PMB協(xié)同的化合物。
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