由于bfmA和bfmK組織在一個(gè)操縱子中，bfmK（ΔSmlt4208）的插入失活可能對(duì)整個(gè)操縱子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生極性效應(yīng)。為避免此缺陷，使用自殺載體pK18mobsacB通過(guò)同源雙交換方法構(gòu)建了bfmA和bfmK的框內(nèi)缺失突變體（IFD-bfmA和IFD-bfmK）。同時(shí)，將全長(zhǎng)bfmA和bfmK序列PCR擴(kuò)增并插入廣宿主范圍載體pBBRMCS2的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建兩個(gè)重組載體。然后將重組載體轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的突變體中以遺傳互補(bǔ)突變（分別為菌株IFD-bfmA-bfmA和IFD-bfmK-bfmK）。在這兩個(gè)構(gòu)建體中，載體攜帶的bfmA和bfmK處于PlacZ啟動(dòng)子的控制下。測(cè)試了這些菌株的生物膜形成能力。如圖4D所示，IFD-bfmA和IFD-bfmK突變體的生物膜量分別顯著降低至野生型菌株水平的61%和53%，而遺傳互補(bǔ)幾乎完全抑制了由基因缺失引起的影響。還確定了這些菌株的細(xì)菌生長(zhǎng)（圖4E），結(jié)果顯示bfmA和bfmK的框內(nèi)缺失突變體以及互補(bǔ)的IFD-bfmK-bfmK菌株與野生型菌株生長(zhǎng)相同。互補(bǔ)的IFD-bfmA-bfmA菌株比其他菌株生長(zhǎng)更慢，這可能是由bfmA的過(guò)表達(dá)引起的，因?yàn)樵谄滢D(zhuǎn)錄的Plac啟動(dòng)子在被測(cè)試的生長(zhǎng)條件下具有高活性。這一結(jié)果再次排除了突變體中生物膜形成減少是由細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢引起的可能性。此外，bfmA和bfmK突變體的鞭毛、細(xì)胞外蛋白酶和淀粉酶活性以及對(duì)多種抗生素的敏感性沒(méi)有顯著改變（數(shù)據(jù)未顯示）。綜上所述，以上分析表明TCS BfmA-BfmK控制嗜麥芽窄食單胞菌中的生物膜發(fā)育。
使用ChIP篩選BfmA調(diào)控的下游基因
BfmA-BfmK TCS的調(diào)控子此前未被研究。我們使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了BfmA和BfmK可能的功能伙伴。根據(jù)基因組鄰接、共現(xiàn)或不同物種中的基因融合事件等信息判斷，BfmK和BfmA各自可能與10個(gè)蛋白質(zhì)存在相互作用（評(píng)分>0.850）（見補(bǔ)充材料中的圖S3A和B），其中三個(gè)是其他HKs（Smlt0977[PhoR]、RpfC[Smlt2234]和SmeS[Smlt4477]）。這些蛋白質(zhì)中的六對(duì)，即PhoB-PhoR、Smlt1218-Smlt1219、Smlt1540-Smlt1541、Smlt3944-Smlt3949、SmeS-SmeR和BfmA-BfmK，它們本身在基因組中成簇分布，表明與TCS BfmA-BfmK有很強(qiáng)的功能關(guān)聯(lián)。
由于BfmA是一個(gè)典型的OmpR家族RR，其C端輸出結(jié)構(gòu)域是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TF）區(qū)域（151至228個(gè)氨基酸），我們推測(cè)這些相關(guān)蛋白編碼基因中的一些在轉(zhuǎn)錄水平上受BfmA直接調(diào)控。因此，我們通過(guò)DOOR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了這些相互作用蛋白編碼基因的15個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)，并根據(jù)這些操縱子的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)了PCR引物（見補(bǔ)充材料中的圖S3C）。隨后使用ChIP結(jié)合半定量PCR來(lái)篩選可能與TF BfmA結(jié)合的DNA。為進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，我們構(gòu)建了另一個(gè)bfmA互補(bǔ)菌株，類似于IFD-bfmA-bfmA菌株，但在bfmA序列的終止密碼子5'端添加了His6表位標(biāo)簽編碼序列。將該DNA插入片段克隆到pBBRMCS2載體中，用于互補(bǔ)bfmA突變體（菌株IFD-bfmA-bfmA）。使用針對(duì)BfmA-His6的單克隆抗體，基于該重組菌株（IFD-bfmA-bfmA）進(jìn)行ChIP。如圖5A所示，即使使用輸入DNA樣品作為DNA加樣對(duì)照，也無(wú)法通過(guò)PCR擴(kuò)增出PSmlt1216、PSmlt1423、PSmlt3944和PSmlt4477的啟動(dòng)子區(qū)域，表明這些順式調(diào)控序列存在顯著的遺傳多態(tài)性。此外，PSmlt1436、PSmlt1540、PSmlt2233、PSmlt2700和PSmlt2801的PCR產(chǎn)物在樣品中缺失，表明這些啟動(dòng)子不與BfmA結(jié)合。因此，上述九個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域被排除在后續(xù)分析之外。然而，與使用來(lái)自缺乏His6標(biāo)簽的IFD-bfmA-bfmA對(duì)照菌株的共免疫沉淀DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的背景對(duì)照相比，來(lái)自IFD-bfmA-bfmA*ChIP樣品的PSmlt0570、PSmlt0800、PSmlt0978、PSmlt3568、PSmlt3949和PSmlt4209的PCR產(chǎn)物量顯著增加（圖5A），表明BfmA-His6在體內(nèi)直接結(jié)合這些啟動(dòng)子區(qū)域，相應(yīng)的基因或操縱子受BfmA調(diào)控。
bfmA正向調(diào)控其自身操縱子和Smlt0800的轉(zhuǎn)錄
為了評(píng)估BfmA對(duì)其下游候選基因的調(diào)控效果，我們選擇了六個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域可被BfmA結(jié)合的操縱子，并通過(guò)半定量RT-PCR比較了野生型菌株和IFD-bfmA突變體中mRNA的量。如圖5B所示，未觀察到代表性基因Smlt3949和Smlt3568的陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，表明在本研究使用的生長(zhǎng)條件下它們的轉(zhuǎn)錄水平太低而無(wú)法檢測(cè)到。Smlt0570和Smlt0978的mRNA量在測(cè)試的菌株中保持穩(wěn)定（圖5B），定量實(shí)時(shí)PCR也顯示它們的mRNA水平在野生型菌株和bfmA突變體之間相似（見補(bǔ)充材料中的圖S4）。這些結(jié)果表明，盡管存在TF-啟動(dòng)子結(jié)合事件，這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與BfmA的控制無(wú)關(guān)。Smlt0800和bfmK的轉(zhuǎn)錄水平在IFD-bfmA突變體中顯著降低，而bfmA的遺傳互補(bǔ)將其轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)至接近或高于野生型水平，表明BfmA作為正向調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)它們的表達(dá)。
為了驗(yàn)證上述結(jié)果，采用定量實(shí)時(shí)PCR比較Smlt0800和bfmK的mRNA量。獲得的結(jié)果與半定量RT-PCR測(cè)定結(jié)果非常吻合（圖5C）；bfmA的框內(nèi)缺失導(dǎo)致Smlt0800和bfmA的mRNA量分別減少60%和96%，并且這些減少幾乎完全被突變體中bfmA的遺傳互補(bǔ)所抑制（圖5C）。綜上所述，結(jié)果表明bfmA正向自動(dòng)調(diào)節(jié)其自身操縱子的轉(zhuǎn)錄。此外，BfmA也是一個(gè)正向調(diào)節(jié)因子，控制Smlt0800的轉(zhuǎn)錄，該基因編碼一種參與?；?CoA水解的?；?CoA硫酯酶（命名為AcoT）。
BfmA結(jié)合acoT的啟動(dòng)子區(qū)域以調(diào)控其表達(dá)和生物膜
為了驗(yàn)證體內(nèi)ChIP-PCR結(jié)果并確定BfmA是否具有雙鏈DNA結(jié)合活性，通過(guò)PCR擴(kuò)增了bfmA-bfmK操縱子和acoT啟動(dòng)子區(qū)域的200 bp序列，用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，并用作體外EMSA的探針。如圖6A和B所示，BfmA重組蛋白與標(biāo)記的PbfmA和PSmlt0800 DNA探針形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。BfmA與兩種探針的結(jié)合事件是特異性的，因?yàn)榧尤霛舛冗f增的未標(biāo)記DNA探針逐漸與32P標(biāo)記的探針競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致同位素信號(hào)減弱或完全消失。綜上所述，體外和體內(nèi)證據(jù)支持BfmA直接結(jié)合acoT和bfmA-bfmA操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域并正向控制其轉(zhuǎn)錄的論斷。
為了評(píng)估BfmA調(diào)控的acoT表達(dá)是否與生物膜相關(guān)，構(gòu)建了acoT的框內(nèi)缺失突變體（IFD-acoT）。如圖6C所示，acoT的缺失導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞聚集顯著減少（38%）。雖然通過(guò)全長(zhǎng)acoT基因進(jìn)行遺傳互補(bǔ)（菌株IFD-acoT-acoT）并未完全將缺陷恢復(fù)至野生型水平，但確實(shí)使突變體的細(xì)菌生物膜顯著增加。此外，當(dāng)acoT在bfmA突變體（菌株IFD-bfmA-acoT）中過(guò)表達(dá)時(shí)，由bfmA突變引起的生物膜缺陷被顯著抑制，盡管未完全恢復(fù)。這些遺傳實(shí)驗(yàn)表明acoT也參與生物膜發(fā)育，并且acoT轉(zhuǎn)錄減少是bfmA突變體生物膜缺陷的原因之一。
討論
HKs是細(xì)菌用于檢測(cè)環(huán)境刺激的主要細(xì)胞傳感器；因此，它們被認(rèn)為是開發(fā)新型抗生素化學(xué)品的候選分子靶點(diǎn)?；趯?duì)HK基因特征（62個(gè)基因）的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)（圖1），本研究成功構(gòu)建了醫(yī)院感染病原體嗜麥芽窄食單胞菌的51個(gè)HK基因突變體，并鑒定出許多在以下方面存在表型缺陷的突變體：菌落形態(tài)、細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基上的游動(dòng)能力以及在聚苯乙烯表面的生物膜形成（圖2和3）。在這些HK基因中，分子分析揭示了一個(gè)TCS，即BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），控制生物膜發(fā)育（圖4D）?；诒狙芯渴占纳锘瘜W(xué)證據(jù)，BfmK是一個(gè)具有自動(dòng)激酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的HK（圖4C），而BfmA是一個(gè)在體外和體內(nèi)能夠結(jié)合雙鏈DNA的轉(zhuǎn)錄因子（圖5和6）。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)搜索預(yù)測(cè)BfmA-BfmK系統(tǒng)可能的功能伙伴后，隨后的ChIP-PCR篩選鑒定出六個(gè)被BfmA結(jié)合的啟動(dòng)子。定量實(shí)時(shí)PCR和EMSA表明，BfmA直接結(jié)合bfmA-bfmK操縱子和一個(gè)酰基-CoA硫酯酶編碼基因（acoT,Smlt0800）的5'順式調(diào)控序列，并正向調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明BfmA-BfmK TCS具有自動(dòng)調(diào)節(jié)功能，并控制acoT的mRNA水平，而acoT被證明參與生物膜形成（圖6C）。據(jù)我們所知，這是首個(gè)系統(tǒng)研究嗜麥芽窄食單胞菌中TCS生物學(xué)功能的研究。它將促進(jìn)我們未來(lái)旨在對(duì)抗這種細(xì)菌病原體引起的致命感染的研究。
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