結(jié)果
嗜麥芽窄食單胞菌編碼具有多種結(jié)構(gòu)域組成的組氨酸激酶。由于嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637的完整基因組尚未測序，本研究使用嗜麥芽窄食單胞菌K279a基因組作為參考基因組。根據(jù)原核雙組分系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫，該基因組包含60個HK基因，其中16個是混合HK類型，每個都包含一個額外的接收器結(jié)構(gòu)域作為磷酸化接受體。獨立的數(shù)據(jù)庫搜索還顯示Smlt2710是一個HWE HK（一組在假定的N和G1框內(nèi)分別具有特征性His和Trp-Glu殘基的HK組）。此外，Smlt4131含有一個具有保守N、G1和G2框的ATP酶結(jié)構(gòu)域，但缺乏典型的HK H框，表明它是一個退化的HK。Smlt2710和Smlt4131也被納入分析，因此本研究共檢查了嗜麥芽窄食單胞菌的62個推定的HK基因（圖1）。
與嗜麥芽窄食單胞菌近緣的黃單胞菌屬成員的HK基因比較顯示，黃單胞菌屬中與毒力相關(guān)的HKs的所有直系同源物，包括RpfC（Smlt2234）、VgrS（或ColS,Smlt3765）、PhoQ（Smlt0278）、RavS（Smlt2324）、RavA（Smlt2322）、RaxH（Smlt3567）和HpaS（Smlt4106），也存在于嗜麥芽窄食單胞菌K279a中（圖1）。由于嗜麥芽窄食單胞菌不是植物病原體，這些與毒力相關(guān)的HKs在兩個細菌類群（窄食單胞菌屬和黃單胞菌屬）之間的信號檢測方面可能表現(xiàn)出細微的功能分化。這些HK基因中的大多數(shù)（56個基因）在基因組附近至少含有一個RR基因。例外是Smlt0107、Smlt0570、Smlt3019、Smlt3625、Smlt3730和Smlt4540；這六個HKs是孤兒，其同源RRs可能缺失或位于其他基因組位點上。
HK基因的系統(tǒng)插入失活和突變體的表型表征。為了獲得嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637中HK基因的突變體文庫，我們最初旨在構(gòu)建包含HK基因截短DNA序列（300至450 bp）作為插入片段的重組自殺載體（pK18mob）。在嗜麥芽窄食單胞菌K279a基因組中預測為HKs的62個基因中，獲得了60個重組載體（見補充材料中的圖S1）。兩個基因，Smlt1219和Smlt4540，未能通過各種引物進行PCR擴增，表明它們不存在于嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637基因組中。從這些自殺載體開始，共獲得了51個插入突變體，并通過PCR進行了驗證（表1）。盡管付出了巨大努力，但11個基因（Smlt1219,Smlt1437,Smlt1541,Smlt2322[ravA],Smlt2382,Smlt2646,Smlt3765[vgrS],Smlt3948,Smlt4131,Smlt4540,和Smlt4627）被證明很難敲除。這些基因在嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637中可能是必需的，或者它們的失活可能導致在本研究使用的培養(yǎng)條件下嚴重的生長缺陷。
在豐富NYG平板（1.5%瓊脂）和半固體NYG平板（0.1%瓊脂）上分別觀察了HK基因突變體的菌落形態(tài)和游動性（圖2），并測量了所有突變體在NYG培養(yǎng)基中的生長曲線（見補充材料中的圖S2）。五個基因（Smlt0769,Smlt0882,Smlt0977,Smlt1636,和Smlt1785）的突變體比野生型菌株或其他突變體生長顯著緩慢（見補充材料中的圖S2）。Smlt0882是腸桿菌莢膜合成中RcsC的直系同源物。RcsC HK調(diào)節(jié)細菌包膜應激反應，其突變通常影響細胞包膜完整性。Smlt1636在其他細菌中的直系同源物尚未被研究。然而，這兩個基因（Smlt0882和Smlt1636）的失活也降低了細菌的游動能力（圖2C），這可能是由它們緩慢的生長速率引起的。圖2C和補充材料中的表S1顯示，除了這兩個基因突變體外，還有其他七個突變體也表現(xiàn)出游動能力下降；它們是Smlt1785、Smlt2260(cheA)、Smlt2267(cheA2)、Smlt2324(ravS)、Smlt2380、Smlt2710和Smlt3944突變體。在這些基因產(chǎn)物中，Smlt2260和Smlt2267分別是大腸桿菌生物傳感器CheA和CheA2的直系同源物，表明它們參與趨化性調(diào)節(jié)。Smlt2324(RavS)、Smlt2380、Smlt2710和Smlt3944是含有PAS結(jié)構(gòu)域的HKs，負責檢測氧氣、氧化還原電位或光，從而表明這些信號對嗜麥芽窄食單胞菌的游動性至關(guān)重要。
嗜麥芽窄食單胞菌生物膜缺陷突變體的系統(tǒng)篩選。為了研究HK基因突變體的生物膜形成能力，收集在豐富NYG培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的細菌細胞并洗滌，將各自的濃度調(diào)整至OD???為0.4。將等體積的細菌培養(yǎng)物（20微升）接種到每個孔含有180微升新鮮NYG培養(yǎng)基的96孔板中。然后將板在28°C孵育5小時，并使用傳統(tǒng)的結(jié)晶紫染色法計算生物膜量（圖3A）。同時，通過測定每種培養(yǎng)物的OD???吸光度值來估計孔中的細菌生長（圖3B）。為了估計相對于細菌生長的生物膜形成，計算了生物膜量與浮游細菌（OD???）的比率（圖3C）。結(jié)果顯示，突變體（ΔSmlt0596,ΔSmlt0884,ΔSmlt3625,和ΔSmlt4477）的生物膜與生長比率與野生型菌株相比沒有顯著改變。
九個突變體（ΔSmlt0158,ΔSmlt0595,ΔSmlt0882,ΔSmlt1421,ΔSmlt1636,ΔSmlt1785,ΔSmlt2380,ΔSmlt2710,和ΔSmlt3944）的生物膜與生長比率顯著增加，而其他38個突變體的比率降低。特別值得注意的是，Smlt4208（命名為BfmK）的插入失活導致生物膜顯著減少，這在我們之前使用隨機、大規(guī)模轉(zhuǎn)座子突變的研究中也觀察到。有趣的是，雖然rpfC直系同源物（Smlt2234）的插入失活導致生物膜與生長比率顯著降低（圖3C），但其不考慮生長的生物膜量并未減少（圖3A）。這與黃單胞菌屬成員的情況截然不同，后者的rpfC基因突變已被證明會導致細胞間通訊和生物膜形成的明顯缺陷。
Smlt4209-Smlt4208是一個控制生物膜形成的TCS。我們接下來專注于進一步研究Smlt4208，因為其突變體穩(wěn)定地損害了生物膜形成而不影響生長。此外，之前沒有研究過該HK基因的其他直系同源物。如圖4A所示，Smlt4208位于一個基因組位點，該位點包含一個RR基因（Smlt4209）、一個編碼推定的MarR家族轉(zhuǎn)錄因子的基因（Smlt4207）和幾個功能未知的基因。我們使用不同算法進行的操縱子預測存在爭議：ProOpDB預測Smlt4205-Smlt4209形成一個包含五個基因的操縱子，從Smlt4205到Smlt4209，而DOOR數(shù)據(jù)庫的理論預測和MicrobesOnline操縱子預測工具都提出一個僅包含Smlt4208和Smlt4209的操縱子。為了通過實驗解讀該位點的潛在操縱子結(jié)構(gòu)，設(shè)計了一系列引物，并使用RT-PCR檢查這些基因之間的基因間轉(zhuǎn)錄。RT-PCR分析顯示，Smlt4208和Smlt4209確實構(gòu)成一個雙順反子操縱子，因為我們觀察到兩個基因之間PCR產(chǎn)物的擴增，這表明它們形成一個轉(zhuǎn)錄單元并構(gòu)成一個完整的TCS（圖4B）。然而，該分析未能檢測到Smlt4207和Smlt4208之間的轉(zhuǎn)錄，表明Smlt4207是基因組中的一個獨立轉(zhuǎn)錄單位。這一實驗結(jié)果因此支持了DOOR數(shù)據(jù)庫和MicrobesOnline操縱子預測工具的理論預測。因此，我們將該TCS命名為BfmA（Smlt4209）-BfmK（Smlt4208）。
為了驗證BfmK和BfmA是否構(gòu)成一個功能性的TCS，使用pET30a和pET28a分別在大腸桿菌BL21（DE3）細胞中表達全長BfmA和BfmK蛋白。此外，還在對應于BfmA和BfmK蛋白磷酸化位點的遺傳密碼中創(chuàng)建了點突變，這些修飾的基因用于表達重組BfmA（D55A）和BfmK（H237A）蛋白。可溶性BfmA蛋白（純度>98%）、BfmK的反向膜囊泡（BfmK比例>20%）及其重組突變體通過Ni-NTA親和層析成功表達和純化（圖4C）。對重組蛋白進行的體外磷酸化測定顯示，全長BfmK反向膜囊泡能夠使其保守的His-237位點自動磷酸化，而其重組形式BfmK（H237A）未能被磷酸化（圖4C）。這一結(jié)果表明BfmK是一個具有自動激酶活性的典型HK。當BfmA被加入反應混合物時，雖然未觀察到代表磷酸化BfmA（BfmA-P）的條帶，但BfmK-P的磷酸化水平降至對照的約80%。加入BfmA（D55A）蛋白并未降低BfmK-P的水平（圖4C）。這一結(jié)果表明BfmK可以磷酸化其同源BfmA，但BfmA-P可能不穩(wěn)定，半衰期太短而無法檢測到。
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