隨著水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴(kuò)大,水貂經(jīng)過(guò)多年的人工馴化,長(zhǎng)期處于不良飼養(yǎng)環(huán)境下,導(dǎo)致其抗病能力出現(xiàn)大幅度降低,一旦發(fā)病就會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,這也是制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。綠膿桿菌又稱(chēng)為銅綠假單胞菌,廣泛存在于自然界中,能夠引起水貂出血性肺炎,嚴(yán)重危害水貂養(yǎng)殖業(yè)。綠膿桿菌普遍存在較強(qiáng)耐藥性,據(jù)報(bào)道其對(duì)第三代頭孢菌素等的耐藥率高達(dá)60%,急需開(kāi)發(fā)新的抗生素替代品,用于綠膿桿菌病的防治。
噬菌體是一種能夠特異性侵染細(xì)菌的病毒,在自然界中廣泛存在,影響著細(xì)菌的生態(tài)及進(jìn)化。根據(jù)噬菌體侵入和裂解細(xì)菌的特點(diǎn),可將噬菌體分為溶源性噬菌體和烈性噬菌體。烈性噬菌體通過(guò)識(shí)別宿主菌細(xì)胞表面受體吸附于細(xì)菌表面,進(jìn)而快速裂解細(xì)菌,具有種屬特異性強(qiáng)、不影響正常菌群、不受細(xì)菌耐藥性影響的優(yōu)點(diǎn),具有作為抗生素替代品的潛在開(kāi)發(fā)優(yōu)勢(shì)。近年來(lái),烈性噬菌體廣泛應(yīng)用于食品消毒和細(xì)菌病的預(yù)防和治療。
本試驗(yàn)用雙層平板法分離得到了1株綠膿桿菌噬菌體,測(cè)定了該噬菌體的形態(tài)和生物學(xué)特性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)噬菌體制劑防治水貂綠膿桿菌病提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料27株綠膿桿菌臨床分離株由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。水貂糞便樣本采集自青島市膠州水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。
1.2方法
1.2.1噬菌體的分離與純化
水貂糞樣加入500 mL LB肉湯和27株綠膿桿菌新鮮菌液各500μL混勻,37℃過(guò)夜培養(yǎng),增殖噬菌體。樣品經(jīng)過(guò)濾、離心、抽濾后,各取100μL濾液分別加入等量27株綠膿桿菌菌液,雙層平板法分離噬菌體。用單斑法純化分離到的噬菌體。
1.2.2噬菌體的電鏡觀察參
取噬菌體增殖液滴于銅網(wǎng)上,2%磷鎢酸(PTA)染色,干燥后,透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。
1.2.3噬菌體裂解譜的測(cè)定
根據(jù)點(diǎn)樣法測(cè)定噬菌體的裂解譜。分別將27株綠膿桿菌增殖液200μL均勻涂布于普通培養(yǎng)基平板,滴加噬菌體增殖液于平板,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)6 h。
1.2.4噬菌體效價(jià)測(cè)定
將噬菌體增殖液10倍比稀釋后,取100μL各稀釋度的增殖液分別與等量的菌液混勻,用雙層平板法進(jìn)行噬菌體效價(jià)的測(cè)定。
1.2.5噬菌體對(duì)溫度、pH值敏感性的測(cè)定
噬菌體增殖液分別加入不同pH值(2～13)的LB肉湯,37℃水浴分別作用1、2 h和3 h,立即測(cè)定噬菌體效價(jià),繪制噬菌體phage30的pH值穩(wěn)定性曲線(xiàn)。100μL的噬菌體增殖液分別在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中作用20、40 min和60 min,立即測(cè)定噬菌體效價(jià),繪制噬菌體phage30的熱穩(wěn)定性曲線(xiàn)。
1.2.6噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
對(duì)噬菌體增殖液和對(duì)數(shù)期的宿主菌菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別按照感染復(fù)數(shù)為0.001、0.01、0.1、1、10和100的比例混勻至LB肉湯中,37℃振蕩培養(yǎng)至搖清,雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。
1.2.7噬菌體一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定
參照Z(yǔ)hang C等報(bào)道測(cè)定噬菌體一步生長(zhǎng)曲線(xiàn),方法略有改動(dòng)。按最佳感染復(fù)數(shù)比例混勻噬菌體增殖液和宿主菌菌液,37℃孵育5 min,13 000 r/min離心30 s,LB肉湯重復(fù)洗滌兩次,棄上清。用LB肉湯重懸沉淀,37℃震蕩培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)取200μL的增殖液,16 000 r/min離心1 min,測(cè)噬菌體效價(jià)。繪制一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
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