研究簡介
盡管環(huán)境應(yīng)激在促進(jìn)衰老過程中可能扮演重要角色，但其與衰老之間的關(guān)系尚不清楚。以往研究已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種能夠延長壽命的突變基因，但大多數(shù)基因的作用機制并不明確。本研究利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為模型生物，因為其基因組規(guī)模的單基因缺失突變體庫可用于評估多種環(huán)境應(yīng)激條件下的應(yīng)激反應(yīng)。研究人員檢測了46種長壽酵母突變體在四種不同應(yīng)激條件（氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、DNA損傷應(yīng)激和熱應(yīng)激）下的生長特性。通過聚類算法分析應(yīng)激反應(yīng)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)缺乏線粒體AAA蛋白酶基因AFG3的細(xì)胞與缺乏細(xì)胞質(zhì)大亞基核糖體蛋白的長壽突變體具有相似的應(yīng)激反應(yīng)特征，即這些細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯減少、對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑（如吐溫霉素）的抗性增強，且這種抗性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)無關(guān)，同時其壽命延長與Sir2蛋白去乙?；笩o關(guān)，但依賴于Gcn4轉(zhuǎn)錄因子。本研究的核心目標(biāo)是探索長壽突變體的應(yīng)激反應(yīng)特征，特別是線粒體蛋白Afg3在細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯和衰老過程中的作用。研究團(tuán)隊通過對46種長壽酵母突變體的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)分析，揭示了Afg3缺失細(xì)胞與缺乏細(xì)胞質(zhì)大亞基核糖體蛋白的長壽突變體之間的相似性，從而發(fā)現(xiàn)了Afg3在調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激抗性以及酵母壽命中的新角色。
本研究不僅揭示了Afg3在細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯和衰老過程中的新角色，還提供了一種通過應(yīng)激反應(yīng)特征來預(yù)測未知因素的長壽途徑的新方法，為深入理解細(xì)胞如何感知和響應(yīng)線粒體應(yīng)激以及這些響應(yīng)如何影響壽命和衰老提供了新的視角和研究方向。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀被用于定量評估46種長壽酵母突變體在不同應(yīng)激條件下的生長特性。Bioscreen C是一種集搖床、培養(yǎng)箱和讀板器于一體的設(shè)備，能夠在多種條件下為酵母細(xì)胞的生長提供高質(zhì)量的生長速率測定。Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在不同應(yīng)激條件下（如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、DNA損傷應(yīng)激和熱應(yīng)激）測定46種長壽酵母突變體的生長速率。通過測量細(xì)胞密度（OD值），Bioscreen能夠提供線性的細(xì)胞密度估計，范圍從OD 0.1到1.0，從而實現(xiàn)高精度的生長速率測定。
實驗結(jié)果
結(jié)果表明Afg3缺失細(xì)胞對吐溫霉素的抗性增強并不依賴于Hac1（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子），且其壽命延長也不依賴于Hac1。此外，Afg3缺失細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯顯著減少，但這種減少并不涉及大核糖體亞基的特異性耗竭。研究還發(fā)現(xiàn)，Afg3缺失細(xì)胞對熱應(yīng)激的耐受性與大亞基核糖體蛋白缺失突變體相似，且在15°C的低溫條件下，這些細(xì)胞對吐溫霉素的抗性并未增強，這進(jìn)一步支持了Afg3和大亞基核糖體蛋白通過類似機制影響應(yīng)激抗性和壽命的觀點。此外，Afg3缺失細(xì)胞的壽命延長與Gcn4蛋白水平的增加有關(guān)，且與SIR2和FOB1的缺失無關(guān)，但與Gcn4的缺失有關(guān)。這些結(jié)果表明，Afg3的缺失通過一種與大亞基核糖體蛋白缺失突變體類似的機制延長壽命，即通過減少細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯來實現(xiàn)。
圖1、對圖尼霉素反應(yīng)的長壽菌株的生長抑制。（a）顯示了與野生型BY4742相比，相對生長抑制顯著變化（p<0.05）的長壽菌株。對照敏感菌株hac1Δ在培養(yǎng)基中未生長。b-d）0、1或5μg/mL圖尼霉素中野生型、rpl20bΔ和afg3Δ菌株的代表性生長曲線。（e）比較每個長壽突變體的復(fù)制壽命百分比變化與生長速率百分比變化的散點圖。
圖2、長壽菌株對Paraquat的生長抑制(A)顯示與野生型BY4742相比，長壽菌株在相對生長抑制上有顯著變化（P<0.05）。對照敏感株ctt1Δ、cta1Δ、sod1Δ用于比較。誤差棒為SEM。(B–D)野生型、rpl20bΔ和afg3Δ菌株在0、5或10 mM Paraquat下的代表性生長曲線。(E)散點圖比較每個長壽突變株的復(fù)制壽命百分比變化與生長速率百分比變化。
圖3.響應(yīng)MMS的長壽菌株的生長抑制。（a）顯示了與野生型BY4742相比，相對生長抑制顯著變化（p<0.05）的長壽菌株。顯示了對照敏感的rad52Δ應(yīng)變以供比較。誤差線是s.e.m。（b-d）野生型、rpl20bΔ和afg3Δ菌株在0、0.005%或0.01%MMS中的代表性生長曲線。（c）比較每個長壽突變體的復(fù)制壽命百分比變化與生長速率百分比變化的散點圖。
圖4、afg3Δ和rpl20bΔ菌株的Hac1獨立Tunicamycin抵抗性。(A)野生型BY4742、afg3Δ、hac1Δ和afg3Δhac1Δ菌株在不同Tunicamycin濃度下的平均倍增時間。afg3Δhac1Δ雙突變株在0.25μg/mL Tunicamycin下仍可生長（雖非常緩慢），而hac1Δ無法生長，表明存在Hac1獨立的Tunicamycin抵抗性。(B)顯示各菌株的復(fù)制壽命曲線，括號內(nèi)為平均壽命。afg3Δ的壽命延長不依賴Hac1。(C)指定菌株在不同Tunicamycin濃度下的點斑實驗。點斑按1:10稀釋，平板在30°C下培養(yǎng)3天。
圖5、AFG3缺失通過Sir2獨立、Gcn4依賴機制減少細(xì)胞質(zhì)翻譯并延長壽命。(A)野生型BY4742和afg3Δ對數(shù)期酵母的代表性多核糖體譜。AFG3缺失導(dǎo)致核糖體從高翻譯mRNA轉(zhuǎn)移至未結(jié)合形式。曲線按80S自由亞基和雙核糖體（2R）之間的最小值歸一化。(B)三重復(fù)多核糖體的峰面積定量。*P<0.05，ns=無顯著性，誤差棒為SEM。(C–F,H)指定菌株的復(fù)制壽命曲線。括號為平均壽命。afg3Δ的壽命延長依賴Gcn4，但不依賴Sir2或Fob1；與rpl20bΔ或膳食限制（0.05%葡萄糖）組合不會產(chǎn)生疊加的壽命延長效果。(G)流式細(xì)胞術(shù)分析對數(shù)期基因組標(biāo)記Gcn4-GFP菌株。
總結(jié)
本論文研究中，研究人員系統(tǒng)分析了46株長壽基因缺失株在四種應(yīng)激條件下的反應(yīng)譜。盡管環(huán)境應(yīng)激在促進(jìn)衰老方面可能起著重要作用，但這種關(guān)系仍然理解不足。為了更全面地刻畫這種相互作用，研究者在四種不同應(yīng)激條件（氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、DNA損傷應(yīng)激及熱應(yīng)激）下，分析了46株長壽酵母突變株的應(yīng)激反應(yīng)譜，并根據(jù)應(yīng)激反應(yīng)特征對基因進(jìn)行了分組。出乎意料的是，缺失線粒體AAA蛋白酶基因AFG3的細(xì)胞，與缺失細(xì)胞質(zhì)大亞基核糖體蛋白的長壽突變株聚類最為接近。與這些核糖體蛋白突變株相似，afg3Δ細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯下降、對tunicamycin的抗性增強（且獨立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)），并呈現(xiàn)出Sir2非依賴但Gcn4依賴的壽命延長。這些數(shù)據(jù)揭示了一個意想不到的聯(lián)系：線粒體蛋白酶、細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯與衰老之間存在密切關(guān)系。Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它不僅提供了高精度的生長速率測定，還能夠量化細(xì)胞在不同應(yīng)激條件下的反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)對于揭示長壽突變體的應(yīng)激反應(yīng)特征和壽命延長機制至關(guān)重要。通過Bioscreen C全自動生長曲線分析儀，研究者能夠系統(tǒng)地評估46種長壽酵母突變體在多種應(yīng)激條件下的生長特性，從而為理解細(xì)胞如何感知和響應(yīng)線粒體應(yīng)激以及這些響應(yīng)如何影響壽命和衰老提供了重要的數(shù)據(jù)支持。本研究不僅揭示了Afg3在細(xì)胞質(zhì)mRNA翻譯和衰老過程中的新角色，還提供了一種通過應(yīng)激反應(yīng)特征來預(yù)測未知因素的長壽途徑的新方法，為深入理解細(xì)胞如何感知和響應(yīng)線粒體應(yīng)激以及這些響應(yīng)如何影響壽命和衰老提供了新的視角和研究方向。
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