討論
總體與活體土壤原核生物群落的差異
本研究發(fā)現(xiàn)，除堿性緩沖液洗滌法外，其他胞內(nèi)DNA提取方法均顯著降低了土壤原核生物多度（圖1A）。該結(jié)果與多項(xiàng)研究一致，表明胞外DNA的存在可能導(dǎo)致原核生物多度的高估。堿性緩沖液洗滌的不一致結(jié)果主要?dú)w因于其促進(jìn)微生物細(xì)胞裂解的能力。已有研究表明，堿性磷酸鹽溶液洗滌可使DNA產(chǎn)量增加24%，從而抵消甚至逆轉(zhuǎn)胞外DNA去除所導(dǎo)致的損失。此外，與其他方法相比，堿性緩沖液洗滌較低的胞外DNA去除效率也可能是導(dǎo)致上述不一致性的原因（圖6）。
與許多研究相似，我們觀察到16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著高于16S rDNA基因拷貝數(shù)（圖1A）。這種差異源于rRNA與rDNA的內(nèi)在固有差異，即單個(gè)rDNA分子可轉(zhuǎn)錄為多個(gè)rRNA分子。綜上所述，土壤胞外DNA可能導(dǎo)致微生物多度的高估，而DNase預(yù)消化和PMA處理可有效緩解這一影響。與之前的一些研究相反，我們的研究表明，去除胞外DNA并未導(dǎo)致土壤原核生物豐富度的顯著下降（圖1B）。僅有采用DNase預(yù)消化法的分析才觀察到顯著的多樣性減少（圖1B），而且在基于總DNA提取所表征的原核生物群落中僅發(fā)現(xiàn)了75個(gè)特有的ASV（圖S1）。這一矛盾主要?dú)w因于胞內(nèi)DNA提取的土壤上樣量不同。具體而言，一些研究僅使用0.03 g土壤進(jìn)行胞內(nèi)DNA提取，而本研究則使用了0.5 g土壤進(jìn)行胞內(nèi)DNA提取。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，DNA提取土壤用量不足會導(dǎo)致微生物豐富度被嚴(yán)重低估，這為本研究與之前研究的不一致性提供了合理解釋。另一個(gè)值得注意的發(fā)現(xiàn)是，基于rRNA分析直接表征的土壤原核生物豐富度明顯高于基于總DNA提取所表征的豐富度（圖1B）。
這一差異的部分原因可能是轉(zhuǎn)錄錯配和提取RNA時(shí)使用的土壤用量較高。此外，rRNA直接表征法對稀有物種的檢測靈敏度較高，也可能是造成這種差異的原因之一。這些發(fā)現(xiàn)表明，胞外DNA對微生物多樣性分析的影響在以前的研究中可能被夸大了。本研究發(fā)現(xiàn)，基于胞內(nèi)DNA和總DNA提取所表征土壤原核生物的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（圖S4–S6），與多項(xiàng)研究一致，其主要原因?yàn)榘麅?nèi)外rDNA的固有差異，它們分別主要源自存活和死亡的微生物。微生物死亡通常由環(huán)境選擇與隨機(jī)過程驅(qū)動：環(huán)境選擇方面，死亡微生物的環(huán)境適應(yīng)能力通常低于活體微生物，從而導(dǎo)致死亡和存活微生物之間出現(xiàn)不同的群落結(jié)構(gòu)；隨機(jī)死亡雖與種群大小相關(guān)，但不同類群的隨機(jī)死亡率差異仍可導(dǎo)致群落差異。此外，由于序列差異會影響胞外DNA的降解機(jī)率及其與土壤礦物質(zhì)的吸附，胞外DNA的降解可能具有高度類群特異性，進(jìn)一步加劇了胞內(nèi)/外DNA所表征群落結(jié)構(gòu)的差異。同時(shí)，rRNA和rDNA所表征的群落結(jié)構(gòu)差異顯著（圖S6D），這一現(xiàn)象已被廣泛報(bào)道，主要源于rRNA與rDNA的生態(tài)意義差異。
由此可見，胞外DNA對微生物群落分析的影響需謹(jǐn)慎評估。胞外DNA的去除顯著簡化了土壤原核生物的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，但增強(qiáng)了網(wǎng)絡(luò)魯棒性（圖3及表S2）。網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度的降低主要源于群落多樣性下降（圖1），并且胞外DNA攜帶的歷史生態(tài)足跡信息會增加網(wǎng)絡(luò)的冗余連接。魯棒性增強(qiáng)則可能與網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度提高有關(guān)（表S2），同時(shí)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)關(guān)鍵類群的變化也可能進(jìn)一步影響魯棒性。這些結(jié)果表明，基于總DNA提取的微生物分析高估了網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，且低估了網(wǎng)絡(luò)的魯棒性。有趣的是，不同核酸提取方法所表征的土壤原核生物群落在構(gòu)建機(jī)制上顯示出高度的一致性（圖4和S9）。因此，在大尺度土壤原核生物群落構(gòu)建機(jī)制分析中，胞外DNA的影響可以忽略不計(jì)。
不同方法所表征活體原核生物群落的差異
與假說一致，本研究發(fā)現(xiàn)，不同方法所表征的土壤活體原核生物多度和多樣性存在顯著差異（圖1、2和表S1）。這些差異主要?dú)w因于各方法胞外DNA去除效率和胞內(nèi)DNA提取效率的差異（圖5和圖6）。例如，堿性緩沖液洗滌法的胞外DNA去除效率顯著低于DNase預(yù)消化法（圖6）。此外，各方法對不同原核生物類群的提取效率差異極大。例如，在大尺度比較實(shí)驗(yàn)和模擬群落實(shí)驗(yàn)中，PMA處理下芽孢桿菌屬的相對多度均顯著低于堿性緩沖液洗滌法（圖2D和5C）。除此之外，如前所述，細(xì)胞rDNA和rRNA的含量具有不同的生態(tài)學(xué)意義。這可能是基于rRNA和胞內(nèi)rDNA方法觀察到的原核生物多度和多樣性存在差異的主要原因。鑒于這些不一致性，在研究活體原核生物群落時(shí)必須考慮不同方法的可靠性。土壤質(zhì)地與有機(jī)質(zhì)含量是核酸提取效率的關(guān)鍵影響因素。例如，有機(jī)質(zhì)含量高的土壤會增加提取液的黏度，從而可能阻礙細(xì)胞的有效裂解和核酸回收（圖S7）；有機(jī)質(zhì)還會干擾DNase活性，降低胞外DNA去除效率。土壤礦物與黏粒可能吸附核酸酶導(dǎo)致失活，降低其生物降解效率，這解釋了DNase預(yù)消化法所表征群落與總?cè)郝涞南嗨菩耘c總有機(jī)碳（TOC）及黏粒含量的負(fù)相關(guān)（圖S7）。粘土含量高或顆粒細(xì)小的土壤可能對胞外DNA有更強(qiáng)的吸附力，從而降低了DNA的可提取性（圖S12）。這些因素可能導(dǎo)致不同類型土壤的提取效率存在顯著差異，從而影響不同研究結(jié)果的可比性。堿性緩沖液洗滌法又稱順序提取法，是同時(shí)提取胞內(nèi)和胞外DNA最廣泛使用的方法。
本研究發(fā)現(xiàn)，該方法最大程度地減少了提取過程對活體原核生物群落結(jié)構(gòu)解析的干擾（圖5），但其去除胞外DNA的效果并不理想（圖6）。事實(shí)上，多項(xiàng)研究指出，使用這種方法獲得的胞外DNA比例遠(yuǎn)低于目前可接受的范圍。值得注意的是，胞外DNA去除方法的效率會因土壤類型和環(huán)境條件的不同而有很大差異。例如，堿性緩沖液洗滌法在低pH土壤中效果較差，可能會導(dǎo)致胞外DNA的殘留（圖S12），會影響此類環(huán)境中微生物群落分析的準(zhǔn)確性。因此，盡管堿性緩沖液洗滌法對胞內(nèi)DNA提取干擾較小，但其胞外DNA去除效率低的問題限制了在活體微生物研究中的應(yīng)用。PMA處理法在去除胞外DNA與提取胞內(nèi)DNA方面效率較高（圖5D及6），但其穩(wěn)定性較差，即使是針對同一樣本的技術(shù)重復(fù)（圖5D及6）。此外，一些研究還強(qiáng)調(diào)了這種方法的不確定性。首先，對某些物種而言，PMA穿透其死亡微生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是個(gè)挑戰(zhàn)。例如，死亡M.avium較厚的細(xì)胞壁和霉菌酸會在很大程度上阻止了PMA的穿透。其次，透光是PMA反應(yīng)的必要條件，因此土壤濁液的高濁度會嚴(yán)重影響PMA反應(yīng)。此外，一些研究使用極少量的土壤提取DNA來解決這一問題，但這可能會因土壤用量不足而導(dǎo)致微生物豐富度被低估。
最重要的是，一些研究發(fā)現(xiàn)PMA處理在反映復(fù)雜活體微生物群落方面存在嚴(yán)重的局限性。與堿性緩沖液洗滌法類似，PMA處理的效率也可能不穩(wěn)定，尤其是在微生物群落復(fù)雜或土壤性質(zhì)多變的土壤中（圖S12）。因此，盡管PMA處理法是目前研究活體微生物最廣泛使用的方法，但在解釋基于該方法的結(jié)果時(shí)必須謹(jǐn)慎。我們建議針對特定的土壤類型進(jìn)一步優(yōu)化該方法，以提高其在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和有效性。
在本研究中，DNase預(yù)消化法去除胞外DNA的效率最高，且對活體群落的表征準(zhǔn)確性也可以接受（圖5和圖6）。該方法試劑成本低，培養(yǎng)時(shí)間短，對高通量測序過程的影響微乎其微，因此是一種有效且適合大尺度研究的方法。綜上所述，我們推薦使用DNase預(yù)消化法提取土壤微生物胞內(nèi)DNA，這是一種前景廣闊、經(jīng)濟(jì)有效的方法。這些發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的見解，可以推廣到水生或沉積物等其他環(huán)境，并為提高不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落分析的準(zhǔn)確性和可靠性奠定基礎(chǔ)。目前，所有基于胞內(nèi)DNA提取的方法均嚴(yán)重依賴于新鮮土壤。然而，微生物群落通常無法在鮮土中長期保持穩(wěn)定，因此這些方法不適合時(shí)間跨度長和缺乏實(shí)時(shí)DNA提取條件的研究。幸運(yùn)的是，rRNA直接表征法為解決這些難題提供了一種很有前景的選擇。然而，其應(yīng)用目前受到兩個(gè)主要認(rèn)知空缺。首先，土壤胞外rRNA的快速降解是使用這種方法研究活體微生物的必要前提。然而，土壤胞外rRNA的降解速率及其影響因素仍有待探索。其次，如上所述，基于rRNA直接表征的土壤微生物多度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)與基于DNA的研究結(jié)果相比存在顯著差異（圖1、2和S6D）。然而，細(xì)胞rRNA含量的生態(tài)學(xué)影響仍存在很大爭議。
因此，未來的研究工作應(yīng)優(yōu)先解決這些問題。盡管本研究結(jié)果提供了有價(jià)值的見解，但需要認(rèn)識到可能影響研究結(jié)論的實(shí)驗(yàn)誤差來源。這些誤差來源包括樣品處理、DNA提取和測序過程，每個(gè)環(huán)節(jié)都可能引入變異。例如，樣本采集過程中的污染、DNA提取操作不當(dāng)，或測序誤差均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，針對每種土壤類型的各方法僅分析了一個(gè)重復(fù)樣本，這限制了我們評估每種處理方法重復(fù)性的能力。在單一采樣點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)取樣將有助于解決這一局限性，并更清晰地揭示方法變異性。這些誤差來源是任何涉及復(fù)雜生物樣本的研究都固有的，在解釋研究結(jié)果時(shí)應(yīng)加以考慮。結(jié)論本研究表明，胞外DNA顯著影響了土壤原核生物多度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)與共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，但對群落構(gòu)建機(jī)制的影響幾乎可以忽略不計(jì)。我們還觀察到，不同方法所表征的土壤活體原核生物多度、豐富度、群落結(jié)構(gòu)和共現(xiàn)模式差異很大。
進(jìn)一步的評估表明，堿性緩沖液洗滌可最大限度地減少提取過程對活體原核生物群落結(jié)構(gòu)的影響，但其去除胞外DNA的效果較差，因此不建議使用。DNase預(yù)消化和PMA處理在去除土壤胞外DNA方面表現(xiàn)出很高的效率，其中DNase預(yù)消化在表征活體原核生物群落上表現(xiàn)出最高的整體效率和穩(wěn)定性。雖然rRNA直接表征有望用于土壤活體微生物的研究，但目前對土壤微生物胞外rRNA降解速率和細(xì)胞rRNA含量的生態(tài)學(xué)意義的認(rèn)知空缺，阻礙了其應(yīng)用。
總之，本研究系統(tǒng)地比較和評估了研究土壤活體微生物的常用方法，為優(yōu)化土壤微生物組研究方法提供了重要依據(jù)。
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