殘留角蛋白在通過Whatman 2號濾紙去除底物并在105°C下干燥后測定。
粗培養(yǎng)液中蛋白酶和角蛋白酶的特性
蛋白酶和角蛋白酶的最適溫度在30-60°C范圍內(nèi)，以5°C為間隔，在0.1 M Tris-HCl緩沖液，pH 7.4中測定。pH的影響在pH 5-11范圍內(nèi)測試，使用0.1 M Britton-Robinson通用緩沖液，在最適溫度下進行。為了確定粗培養(yǎng)液中蛋白酶和角蛋白酶的主要催化類型，在酪蛋白或可溶性角蛋白上的反應在最適條件下進行，之前用以下抑制劑進行20分鐘預處理：PMSF（苯甲基磺酰氟）、NEM（N-乙基馬來酰亞胺）、EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）和激活劑：半胱氨酸、CaCl?。
酶譜法
在酶譜分析之前，使用Labscale TFF系統(tǒng)（Millipore）和帶有Ultracel-10 PLCGC膜（10 kDa截留分子量）的Pellicon XL 50盒濃縮培養(yǎng)液。濃縮的培養(yǎng)上清液與樣品緩沖液（Tris-HCl 0.32 M；pH 6.8；甘油48%；SDS 8%；溴酚藍0.06%）以6:4的比例混合。將樣品上樣到含有酪蛋白/明膠0.1%的8%聚丙烯酰胺凝膠（5%積層膠）上。電泳在2°C下以20 mA進行5.5小時。電泳后，凝膠用Triton-X 2.5%洗滌兩次，用孵育緩沖液（Tris-HCl緩沖液0.05 M，pH 8.6，含CaCl?5 mM和疊氮化鈉0.02%）洗滌一次，并在相同緩沖液中于30°C孵育24小時。為了條帶檢測，凝膠用考馬斯亮藍染色，并用甲醇:乙酸:水（50:10:40）脫色。
結(jié)果
細菌鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育研究
先前研究中指定為B1pz的分離株在分子基礎上被重新鑒定。將16S rDNA部分序列與RDP進行初步比較，揭示了與微球菌屬成員的密切關(guān)系。
通過提交至GenBank數(shù)據(jù)庫證實了與藤黃微球菌菌株NCTC 2665的高度相似性（100%）。在鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株B1pz與藤黃微球菌NCTC 2665和云南微球菌（M.yunnanensis）YIM 65004的一個亞分支密切相關(guān)，具有較高的自舉值（圖1）。該分離株被鑒定為藤黃微球菌（Micrococcus luteus），一種革蘭氏陽性、需氧、不形成孢子的球菌，排列成細胞四聯(lián)體并產(chǎn)生黃色色素。
羽毛肉湯培養(yǎng)基中的角蛋白酶生產(chǎn)
在15天的培養(yǎng)期間，藤黃微球菌B1pz菌株利用羽毛底物作為培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)源，同時伴隨著細胞外蛋白酶的產(chǎn)生。角蛋白分解和酪蛋白分解活性的生產(chǎn)高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)的第四天和第五天之間，最大值分別為32.3 KU和6.0 PU（圖2）。培養(yǎng)基中的羽毛含量對目標酶的生物合成產(chǎn)生影響，影響底物利用率。在底物濃度為1-2%時，角蛋白分解活性水平相當，高于此水平時觀察到生物合成顯著下降（表1）。
盡管如此，在2%羽毛含量時，酪蛋白分解蛋白酶的生產(chǎn)出現(xiàn)輕微刺激。向羽毛培養(yǎng)基中添加額外的補充劑也是角蛋白酶生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。與含有羽毛和酵母提取物的對照培養(yǎng)基相比，添加蛋白胨導致最大角蛋白分解活性刺激了22%（圖3）。葡萄糖幾乎完全抑制了角蛋白酶的生產(chǎn)，但不影響蛋白水解活性。羽毛誘導物的存在對角蛋白酶的生物合成至關(guān)重要，但對酪蛋白分解蛋白酶則不然。然而，測試菌株在羽毛培養(yǎng)基中沒有任何補充劑的情況下無法產(chǎn)生顯著的角蛋白酶水平。
| 羽毛含量[%] | 角蛋白分解活性[KU] | 蛋白水解活性[PU] | pH | 蛋白質(zhì)[mg/mL] | 氨基酸[mM] |
| 1 | 32.3±1.2 | 6.0±0.3 | 9.25 | 1.24 | 1.70 |
| 2 | 34.0±7.2 | 19.3±2.1 | 9.08 | 1.47 | 1.68 |
| 4 | 20.4±6.6 | 7.1±3.2 | 9.05 | 0.38 | 0.17 |
表1-藤黃微球菌在存在1-4%羽毛的培養(yǎng)物中的最大角蛋白酶和蛋白酶活性以及角蛋白水解產(chǎn)物濃度。
對不同角蛋白底物的角蛋白分解潛力
藤黃微球菌B1pz菌株除了能夠有效分解雞羽毛底物外，還能在各種角蛋白材料存在下生長和生產(chǎn)角蛋白酶。在人發(fā)或羔羊毛上培養(yǎng)物中觀察到的最大角蛋白分解活性水平，與雞羽毛培養(yǎng)基相比降低了約50%（圖4）。分離的鴕鳥羽毛羽軸和羽枝被證明是效果差得多的角蛋白酶誘導物，而在含有豬鬃的培養(yǎng)基中未檢測到角蛋白酶活性。測試的菌株在雞羽毛上生長時優(yōu)先產(chǎn)生角蛋白分解酶，而不是在其他高彈性的"硬角蛋白"上，這也反映了在短短4天培養(yǎng)期內(nèi)底物分解程度達到35.3%。表皮角質(zhì)層作為富含細胞角蛋白的"軟"角蛋白的例子，盡管對細菌生物降解具有高度敏感性，但對測試菌株來說仍然是一個中等強度的角蛋白酶誘導物。
粗培養(yǎng)液中角蛋白酶和蛋白酶的初步表征
粗培養(yǎng)液中的角蛋白酶和蛋白酶分別在pH 9.4、55°C和pH 8.6、45°C下表現(xiàn)出總體最佳活性。使用特異性蛋白酶抑制劑的分析揭示了絲氨酸蛋白酶的主導存在，這是由于對PMSF的高敏感性，這指的是對酪蛋白和可溶性角蛋白的活性。然而，硫醇依賴性蛋白酶的顯著組成部分是高度可能的，這通過半胱氨酸的激活和對NEM的敏感性得到驗證。在EDTA存在下角蛋白分解活性的降低，連同Ca2?的巨大激活，可能表明測試的培養(yǎng)液中存在金屬蛋白酶或其他金屬依賴性蛋白酶（表2）。無細胞粗培養(yǎng)液中的角蛋白酶對天然羽毛角蛋白表現(xiàn)出活性，很大程度上受CaCl?添加的影響（數(shù)據(jù)未顯示）。在CaCl?0.5 mM存在下，其為9.8±0.2 KU/h（對應的在沒有CaCl?的可溶性角蛋白上的活性：.3 KU）。
| 抑制劑/激活劑 | 濃度[mM] | 殘余活性[%] | |
| 角蛋白分解活性 | PMSF | 10 | 28 |
| EDTA | 5 | 100 | |
| 10 | 30 | ||
| NEM | 10 | 0 | |
| Cys | 1 | 164 | |
| Ca2? | 5 | 1606 | |
| 蛋白水解活性 | PMSF | 10 | 0 |
| EDTA | 5 | 100 | |
| 10 | 100 | ||
| NEM | 5 | 86 | |
| 10 | 23 | ||
| Cys | 1 | 586 | |
| Ca2? | 10 | 814 |
表2-抑制劑和激活劑對藤黃微球菌B1pz粗培養(yǎng)液中角蛋白酶和蛋白酶活性的影響。
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